소개글
"단백질정제 및 정량"에 대한 내용입니다.
목차
1. 서론
1.1. eGFP의 정의 및 특성
1.2. 6x His-tagged GFP expression system
2. 재조합 단백질 발현 및 정제
2.1. 대장균을 활용한 단백질 발현
2.2. Sonication을 이용한 세포 내 구조체 파괴
2.3. IMAC(Immobilized metal affinity chromatography)를 이용한 단백질 정제
3. 단백질 정량 방법
3.1. UV method
3.2. Biuret 방법
3.3. Lowry method
3.4. BCA method
3.5. Bradford assay
4. 실험 결과
4.1. SDS-PAGE를 통한 단백질 발현 확인
4.2. Lowry assay를 통한 단백질 정량
4.3. Spectrofluorometer를 이용한 단백질 확인
5. 고찰
6. 참고 문헌
본문내용
1. 서론
1.1. eGFP의 정의 및 특성
eGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)는 Aequorea victoria에서 발견된 GFP(Green Fluorescent Protein)를 변형시킨 단백질이다. eGFP는 GFP의 아미노산 중 64번째 phenylalanine이 leucine으로, 65번째 serine이 threonine으로 변이된 돌연변이체이다.
eGFP는 GFP보다 더 많은 빛을 흡수할 수 있어 단백질 정량 실험에서 더 높은 효율을 보인다. eGFP는 293개의 아미노산으로 구성된 32.7kDa 크기의 단백질 monomer이며, excitation 최대 파장이 488nm이고 emission 최대 파장이 509nm이다.
eGFP는 육안으로도 관찰이 가능할 정도로 형광 발현이 강하고 독성이 낮아 단백질 발현 확인 실험에 널리 사용된다. 목표 단백질 유전자 옆에 eGFP를 삽입하면 목표 단백질의 발현량에 따라 eGFP도 같이 발현되어 육안으로 간편하게 발현 정도를 확인할 수 있다.
1.2. 6x His-tagged GFP expression system
6x His-tagged GFP expression system은 Protein tag의 종류 중 하나로, 6개의 Histidine을 구하고자 하는 단백질의 N-terminal 또는 C-terminal에 용합시키는 것이다. 이 시스템은 pET28a vector를 이용해서 5369개의 base pair로 구성되어 있는 plasmid를 숙주 미생물인 BL21(DE3)에 삽입하여 사용한다. 숙주 미생물인 BL21(DE3)은 T7 RNA polymerase를 가지고 있어 기존의 E.coli RNA polymerase 보다 최대 5배 빠른 속도로 transcription을 할 수 있다. 또한 이 plasmid는 Kanamycin 내성을 지니고 있다. 6x Histidine tag는 Ni+2-NTA에 붙는다. 6x His-tag vector는 구하고자 하는 단백질의 C-terminal 또는 N-terminal에 상관없이 붙을 수 있다. 장점으로는 6X Histidine은 크기가 작아서 단백질에 끼치는 영향이 적으며, 항원으로서 기능이 없기 때문에 항체를 제작하는데 있어서 사용하기가 좋다. 또한 변성상태에서도 정제가 가능하므로 단백질을 정제할 때 쉽다. 단점으로는 Histidine tag는 비특이적인 결합이 많아서 발현수준이 높을 때에는 크게 상관은 없지만 낮을 경우에는 다른 물질과 binding을 하므로 오차가 일어날 수 있다. 그리고 Histidine tag를 붙이면 불용성이 되어 봉입체(inclusion body)로 될 확률 있어 GST, GSH 등 다른 tagging system을 이용하기도 한다.
2. 재조합 단백질 발현 및 정제
2.1. 대장균을 활용한 단백질 발현
대장균을 활용한 단백질 발현은 재조합 단백질 발현 및 정제 실험에서 매우 중요한 과정이다. 대장균은 단백질 발현을 위한 숙주세포로 널리 사용되며, 박테리아의 빠른 성장과 유전자 조작의 용이성 때문에 선호된다.
재조합 단백질 발현에는 대장균 균주 BL21(DE3)가 자주 사용된다. BL21(DE3) 균주는 T7 RNA polymerase 유전자를 가지고 있어 T7 프로모터에 의해 조절되는 유전자로부터 매우 높은 수준의 단백질 발현이 가능하다. 또한 이 균주는 lac 유전자 발현 억제 물질인 lacI를 발현하므로, IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 유도에 의해 조절된 단백질 발현이 가능하다.
단백질 발현을 위해 먼저 목적 유전자를 발현 벡터에 클로닝한다. 이때 6x His-tagged GFP expression system과 같이 단백질 정제를 위한 tag가 연결되어 있는 벡터를 사용하는 것이 일반적이다. 이 벡터를 대장균 BL21(DE3) 세포에 형질전환하여 형질전환체를 선별한다.
선별된 형질전환체를 항생제가 포함된 배지에서 배양하여 목적 단백질의 발현을 유도한다. 일반적으로 OD600 값이 0.4-0.6 정도에 도달했을 때 IPTG를 처리하여 T7 프로모터 유도 발현을 유도한다. IPTG 처리 후 일정 시간 동안 배양하여 충분한 양의 목적 단백질이 발현되도록 한다.
발현된 단백질은 세포 배양 후 원심분리를 통해 세포 pellet을 얻고, 이후 세포 내 구조체 파괴 및 정제 과정을 거쳐 최종적으로 순수한 단백질을 얻을 수 있다. 이러한 대장균을 활용한 단백질 발현 기술은 다양한 산업 및 연구 분야에서 널리 활용되고 있다.
2.2. Sonication을 이용한 세포 내 구조체 파괴
Sonication을 이용한 세포 내 구조체 파괴는 단백질을 정제하기 위한 중요한 단계 중 하나이다. 세포 내부에는 다양한 단백질과 핵산 등 여러 가지 화합물들이 존재하는데, 목적 단백질을 분리하기 위해서는 세포벽이나 세포막을 파괴하여 세포 내부 구조체를 분해해야 한다. 이 때 사용되는 방법 중 하나가 sonication이다.
Sonication은 10~20kHz의 초음파를 이용하여 세포벽 또는 세포막을 부수거나 세포 내 구조를 파괴하는 방법이다. 초음파로 인한 공진동현상으로 생성된 거품진동으로 인한 힘을 이용하여 세포 ...
참고 자료
Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky, Jackson, 2012, Campbell Biology Ninth Edition, PEARSON,
최철희, 창의와 소통, 세포생물학, 2013, 1st ed., pp.76-78
Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman(2016), The cell, 7th ed, Sinauer Associates, p70~76
식품공전, 2023
농촌진흥청국립농업과학원 농식품올바로 2023. Available at:
https://koreanfood.rda.go.kr/kfi/fct/fctFoodSrch/list?totalSearchYn=Y
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