본문내용
1. 실험 개요
1.1. 실험 목적
실험 목적은 재조합 단백질(Naa30)을 정제하는 것이다. 세포는 여러 종류의 단백질을 만들어내는데, 이 중 특정한 단백질을 얻어내기 위해 단백질 정제가 이뤄진다. 내생적 단백질(endogenous)은 자연적으로 세포 내에 존재하지만 낮은 농도로 존재하기 때문에 상대적으로 정제가 어렵다. 반면 재조합 단백질(recombinant)은 외부 유전자를 플라스미드 벡터에 삽입하여 숙주 세포에 도입한 후 발현되는 단백질이다. 재조합 단백질은 과 발현이 가능하며 정제를 용이하게 하기 위해 태그(tag)를 부착할 수 있다. 따라서 본 실험에서는 재조합 단백질인 Naa30을 정제하는 것을 목적으로 한다.
1.2. 실험 원리
실험 원리는 다음과 같다. 세포는 여러 종류의 단백질을 만들어내는데, 그 중 특정한 단백질을 얻어내기 위해 단백질 정제가 이뤄진다. 내생적 단백질(endogenous)은 자연적으로 세포 내에 존재하지만 상대적으로 낮은 농도로 존재하기 때문에 정제가 어렵다. 그에 비해 재조합 단백질(recombinant)은 외부 유전자를 플라스미드 벡터에 삽입하여 숙주 세포에 도입한 후 발현되는 단백질이다. 재조합 단백질은 과 발현이 가능하며 정제를 용이하게 하기 위해 태그(tag)를 부착한다.
본 실험에서는 플라스미드인 pET28a vector에 human Naa30 유전자를 클로닝하고, 대장균에 클로닝된 벡터를 도입하여 배양한다. 배양된 대장균에서 재조합 유전자의 발현을 IPTG를 이용해 유도한다. 이후 대장균을 파쇄하여 용해물을 얻고, 친화도 크로마토그래피 중 IMAC(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography)를 이용해 His tag가 부착된 재조합 유전자 단백질을 정제한다. His tag와 Ni 이온의 친화도를 이용하여 목적 단백질을 분리해낸다.
2. 단백질 발현
2.1. 단백질 발현 유도
단백질 발현 유도는 특정한 유전자를 발현시켜 단백질을 대량으로 생산하는 과정이다. 이는 세포 내 다양한 단백질 중 원하는 단백질을 얻기 위해 이루어진다. 대부분의 경우 재조합 단백질 기법을 이용하여 숙주 세포에 외부 유전자를 도입하고, 이를 발현시킨다.
재조합 단백질 기법은 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 플라스미드 벡터에 삽입하여 숙주 세포에 도입하는 방식이다. 이때 벡터에는 유도체를 통해 단백질 발현을 조절할 수 있는 프로모터 서열이 포함되어 있다. 실험에서는 pGEX-4T 벡터를 사용하였는데, 이 벡터는 GST(glutathione-S-transferase)라는 단백질을 코딩하는 유전자를 가지고 있다. 이 GST 단백질은 정제 과정에서 유용한 tag로 활용된다.
단백질 발현을 유도하기 위해서는 세포 배양액에 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)라는 화합물을 처리한다. IPTG는 락토오스의 유사체로, 세포 내에서 Lac repressor 단백질과 결합하여 이를 비활성화시킨다. Lac repressor는 정상적인 경우 lac operon의 promoter 부위에 결합하여 전사를 억제하지만, IPTG가 결합하면 이 억제 작용이 해제되어 lac operon이 발현된다.
이를 통해 pGEX-4T 벡터의 tac 프로모터가 활성화되어 GST-융합 단백질이 발현된다. 즉, IPTG 처리는 숙주 세포 내에서 재조합 단백질의 발현을 유도하는 역할을 한다. 이러한 단백질 발현 유도 과정은 원하는 단백질을 대량으로 생산하기 위한 필수적인 단계라고 할 수 있다.
2.2. IPTG를 이용한 단백질 발현 유도
IPTG를 이용한 단백질 발현 유도는 대장균의 유전자 발현 조절 시스템인 Lac operon을 이용하는 것이다.""
대장균의 Lac operon은 젖당을 분해하는 효소들을 발현하는 유전자 군으로 구성되어 있다. 이 operon에는 조절유전자 lacI가 존재하며, lacI 유전자에서 만들어지는 Lac 억제자 단백질이 operator 부위에 결합하여 operon의 발현을 억제한다.""
그러나 젖당이 세포 내부로 들어오게 되면 Lac 억제자 단백질과 결합하여 operator 부위에서 떨어져 나오게 된다. 이로 인해 RNA polymer...
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