소개글
"pcr / agarose gel running"에 대한 내용입니다.
목차
1. 실험 개요와 원리
1.1. 실험 목적 및 주요 내용
1.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)
1.2.1. PCR의 개념과 원리
1.2.2. PCR에 사용되는 주요 구성 요소
1.3. DNA 전기영동
1.3.1. 전기영동의 원리
1.3.2. Agarose gel의 특성과 사용
2. Genomic DNA 추출 및 정제
2.1. Genomic DNA의 개념
2.2. Genomic DNA 추출 및 정제 과정
2.3. DNA 추출에 사용되는 주요 시약의 역할
3. PCR 실험 과정
3.1. PCR 반응 준비
3.2. PCR 조건 설정
3.3. PCR 실험 절차
4. DNA 전기영동 실험
4.1. Agarose gel 제조 방법
4.2. 전기영동 실험 설정 및 진행
4.3. DNA 염색과 검출
5. 실험 결과
5.1. SIRT1 유전자 분석
5.2. PASKIN 유전자 분석
5.3. 전기영동 결과 해석
6. 실험 고찰
6.1. 전기영동 결과의 영향 요인
6.2. DNA 추출 및 정제의 중요성
6.3. PCR과 전기영동의 연계성
7. 참고 문헌
본문내용
1. 실험 개요와 원리
1.1. 실험 목적 및 주요 내용
이 실험의 목적은 PCR의 원리를 이해하고, 직접 아가로스 겔을 제조하여 전기영동을 수행함으로써 DNA의 크기를 측정하는 것이다. 구체적으로 DNA ladder와 증폭된 PCR 산물의 크기를 비교하여 분석하는 것이 주요 내용이다.
1.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)
1.2.1. PCR의 개념과 원리
PCR(Polymerase Chain Reaction)은 DNA 복제를 연쇄적으로 수행하여 원하는 특정 유전물질을 대량으로 증폭시키는 기술이다. PCR의 개념은 DNA polymerase에 의해 DNA 복제가 연쇄적으로 일어나는 방식을 이용한 것이다. 이중나선 구조의 DNA에서 특정 염기 서열을 복제하기 위해 두 개의 primer를 사용하는데, 이 primer는 복제하고자 하는 DNA 부위의 양 끝에 상보적으로 결합한다. DNA polymerase는 이 primer가 결합한 부분에서부터 새로운 DNA 가닥을 합성해나가며, 이 과정이 반복되면서 원하는 DNA 부위가 지수적으로 증폭된다. PCR의 주요 단계는 denaturation, annealing, extension으로 구성되어 있다. 먼저 높은 온도(92~95℃)에서 DNA 이중나선 구조를 분리하는 denaturation 단계, 그 다음 primer가 template DNA에 결합하는 annealing 단계, 마지막으로 DNA polymerase에 의해 새로운 DNA 가닥이 합성되는 extension 단계를 거친다. 이 3단계 과정을 수십 번 반복하면 초기 DNA 시료로부터 증폭된 많은 양의 DNA를 얻을 수 있다. 이처럼 PCR은 극소량의 DNA 시료로부터 원하는 부위를 선별적으로 증폭할 수 있어, 유전자 분석, 진단, 클로닝 등 다양한 분야에 활용되고 있다.
1.2.2. PCR에 사용되는 주요 구성 요소
PCR에 사용되는 주요 구성 요소는 다음과 같다.
Template DNA는 PCR 반응의 시작물질로 작용하며, PCR 반응에 의해 복제될 대상이 되는 DNA이다. 따라서 template DNA는 원하는 유전자나 유전적 서열을 포함하고 있는 경우가 많다.
한 쌍의 primer는 template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA의 일부분에 상보적인 약 20bp 내외의 짧은 oligonucleotide이다. Primer의 염기서열은 template DNA의 특정 부위의 염기서열에 정확히 상보적이어야 한다.
dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 유전자를 합성하는 재료가 되는 뉴클레오타이드로, PCR 반응에 사용되는 양은 예상되는 PCR product size에 따라 다를 수 있다.
Taq polymerase는 열에 특별히 강한 유전자 합성효소로, PCR에서 사용되는 DNA polymerase이다. Taq polymerase는 Thermus aquaticus로부터 정제한 효소이며, 94°C까지의 높은 온도에서도 효소 기능을 유지할 수 있다.
PCR buffer는 PCR이 효율적으로 일어나도록 최적의 환경을 제공하며, 이 때 Mg2+의 농도가 1.5-2.5mM 정도로 필요하다.
1.3. DNA 전기영동
1.3.1. 전기영동의 원리
전기영동의 원리는 다음과 같다.
전기영동은 DNA의 크기, 전하, 구조에 따라 DNA 분자를 분리하는 방법이다. DNA는 backbone의 인산기(phosphate group)로 인해 전기영동에 사용되는 buffer 속에서 음전하(-)를 띠고 있다. 그래서 전기장에 놓이게 되면 양극(+)으로 이동하게 된다. DNA 분자의 이동속도는 분자량이 작을수록 빨라지고, gel 밀도가 낮을수록 빨라진다. 또한 전류가 약할수록 빨라지며 DNA의 분자량이 같더라도 형태에 따라 움직이는 속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA, linear DNA, circular DNA 순으로 이동속도가 빨라진다.
Agarose gel은 해초로부터 추출되는 물질로서 linear polymer의 형태를 하고 있다. Agarose gel은 주로 TAE buffer에 녹여서 틀에 부어지고, 굳은 후에 사용된다. Gel이 굳으면 matrix 형태가 되는데, 그 밀도는 Agarose gel 농도에 따라 달라진다. DNA의 이동은 1) DNA의 크기가 클수록 느리게 이동하고, 2) DNA의 형태에 따라 이동속도가 다르며, 3) Agarose gel의 농도가 높을수록 느리게 이동한다. 또한 4) 가해지는 전압이 높을수록 이동속도가 빨라진다. 5) 전기영동 buffer의 성분과 이온강도 또한 이동속도에 영향을 미친다.
즉, TAE buffer에 걸리는 전하에 의해 DNA가 끌어당겨지고, matrix 구조를 이룬 Agarose gel이 DNA를 크기별로 나누는 체 역할을 하여 크기와 형태가 다른 각 DNA를 구별해낼 수 있는 것이다.
1.3.2. Agarose gel의 특성과 사용
Agarose gel은 해초에서 추출된 복합 다당류로, 전기영동 실험에서 DNA를 분리하는 데 사용되는 매질이다. Agarose gel은 선형 중합체의 형태를 하고 있으며, TAE buffer에 녹여 사용한다.
Agarose gel이 굳으면 3차원 그물 구조를 형성하게 되는데, 이 그물 구조 사이로 DNA가 이동하게 된다. Agarose gel의 농도가 높을수록 그물 구조의 밀도가 높아져 DNA가 이동하는 속도가 느려진다. 일반적으로 0.3-5%의 Agarose gel을 사용하며, DNA의 크기에 따라 적절한 농도를 선택한다.
Agarose gel은 DNA의 크기, 전하, 구조에 따라 DNA를 분리할 수 있다. DNA는 backbon의 phosphate group 때문에 음(-)전하를 띠게 되어 전기장 하에서 양(+)극으로 이동한다. DNA의 분자량이 클수록, Agarose gel의 농도가 높을수록 이동 속도가 느려진다. 또한 DNA의 구조에 따라서도 이동 속도가 다른데, supercoiled DNA, linear DNA, open circular DNA 순으로 빠르게 이동한다.
Agarose gel은 해상도는 낮지만 200bp부터 50kb까지의 DNA를 분리할 수 있으며, 사용이 간편하고 다루기가 쉬워 전기영동 실험에서 가장 널리 사용되는 매질이다. Agarose gel은 전기영동 buffer인 TAE buffer에 녹여 사용하는데, TAE buffer는 DNA의 음전하를 유지하고 pH를 적절하게 유지하여 DNA의 변성을 방지하는 역할을 한다.
2. Genomic DNA 추출 및 정제
2.1. Genomic DNA의 개념
Genom...
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