본문내용
1. 혈액 DNA 추출
1.1. 실험 목적
1.1.1. 혈액에서 DNA 추출
혈액에서 DNA를 추출하는 것이 실험의 목적이다. 또한 중합효소 연쇄반응(PCR) 산물을 제작하고, 추출한 DNA의 PCR 결과를 전기영동을 통해 확인한다.
PCR은 DNA 사슬 중 목적하는 일부분만을 대량으로 증폭시키는 방법으로, 사이키가 높은 온도에서도 활성이 유지되는 Taq DNA 중합효소를 사용하여 널리 활용되고 있다. PCR 과정은 주형 DNA와 프라이머, DNA 중합효소, dNTP를 함께 넣고 94~96℃로 가열하여 DNA를 두 가닥으로 분리한 뒤, 50~64℃로 온도를 낮추어 프라이머와 중합효소가 외가닥 DNA의 특정 부위에 결합하도록 한다. 이후 다시 온도를 올려 DNA를 합성하는 과정을 반복하면 원하는 DNA가 폭발적으로 증폭된다.
PCR product는 PCR 과정을 거쳐 목적하는 DNA 부위만 대량으로 증폭한 산물이다. 전기영동을 통해 PCR product의 크기와 유전자형을 확인할 수 있는데, 음전하를 띠는 DNA 분자가 양전극 쪽으로 이동하는 속도가 DNA의 크기에 따라 달라지기 때문이다.
실험에 필요한 주요 기구 및 시약으로는 DNA 추출을 위한 AccuPrep 게놈 DNA 추출 키트, PCR product 제작을 위한 PCR Master Mix, 전기영동을 위한 아가로스 겔과 TAE 완충액, Ethidium bromide 등이 있다. 또한 정확한 용량 측정을 위해 마이크로피펫을 사용하며, 전기영동 시 샘플 로딩과 러닝 과정을 거친다.
실험 방법은 다음과 같다. 먼저 프로테아제 K를 뉴클레아제 프리 워터에 녹인다. 혈액 200μL에 gel binding buffer 200μL를 넣고 잘 섞은 뒤 에탄올 400μL를 첨가한다. 이 용액을 binding column tube에 옮기고 원심분리하여 DNA를 결합시킨다. 그 후 세척 버퍼로 씻어주고 elution buffer로 DNA를 용출시킨다. PCR 튜브에 주형 DNA, 프라이머, PCR Master Mix, 증류수를 넣어 PCR을 실행한다. 마지막으로 전기영동을 수행하여 PCR product의 크기와 유전자형을 확인한다.
실험 결과, 전기영동 분석에서 형광색이 잘 관찰되어 DNA 추출과 PCR이 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있다. 실험 과정에서 마이크로피펫 사용법을 조원들에게 알려줄 수 있었고, 이를 통해 실험이 더욱 정확하게 수행되었다. 실험 전반에 걸쳐 실험 목적에 부합하는 결과를 얻을 수 있었다.
1.1.2. PCR 산물 제작
PCR은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)의 약자로, DNA 증폭 기술이다. PCR 원리와 과정을 통해 특정 DNA 부위를 대량으로 복제할 수 있다. 먼저 주형(template) DNA와 함께 특정 부위에 결합하는 프라이머(primer)와 DNA 중합효소, 새로운 DNA 합성을 위한 dNTP를 준비한다. 94~96℃로 가열하면 DNA가 두 가닥으로 분리되며, 이후 온도를 50~64℃로 낮추면 프라이머와 중합효소가 외가닥 DNA에 결합하여 2개의 DNA가 합성된다. 이것이 1주기이며, 이를 반복하면 지수적으로 증폭되어 원하는 DNA 양이 늘어나게 된다. 이렇게 PCR 과정을 통해 얻은 산물을 PCR product라 한다. PCR product는 목표 DNA 부위를 대량으로 복제한 것으로, 이를 활용하여 여러 가지 분석과 응용이 가능하다. 예를 들어 전기영동을 통해 PCR product의 크기를 확인할 수 있으며, 제한효소 처리를 통해 특정 부위가 잘리는지 여부를 확인할 수 있다. PCR 기법은 임상, 유전체 연구, 법의학 등 다양한 분야에서 폭넓게 활용되고 있다.
이처럼 PCR 산물 제작 과정을 통해 특정 유전자 부위를 선택적으로 증폭할 수 있으며, 이를 바탕으로 다양한 분석과 응용이 가능하다.
1.1.3. 추출한 DNA의 PCR결과 전기영동 확인
전기영동은 증폭된 DNA 산물의 크기와 유전자형을 확인하는 실험이다. 먼저 추출한 DNA를 PCR을 통해 증폭한 다음, 전기영동을 실시하여 DNA 띠의 크기와 모양을 관찰한다. 이를 통해 증폭된 DNA 시료의 특성을 확인할 수 있다.
전기영동은 음전하를 띠는 DNA 분자가 양전극 쪽으로 이동하는 원리를 이용한다. 겔 매질을 통과하면서 DNA 분자의 크기에 따라 이동속도가 달라져 크기별로 분리된다. 이때 이미 알고 있는 DNA 크기의 표준물질(DNA ladder)과 비교하면 증폭된 DNA의 크기를 정확히 측정할 수 있다.
실험에서는 전기영동을 통해 추출한 DNA의 PCR 증폭 결과를 확인하였다. 먼저 전기영동 장치에 겔을 장착하고 버퍼를 채운 뒤, PCR 산물과 DNA 마커를 각 웰에 로딩하였다. 전압을 인가하여 전기영동을 진행하면 DNA 분자들이 크기에 따라 분리된다. 이때 형광 염료인 에티듐브로마이드로 염색하면 UV 조사 시 DNA 띠가 가시화된다.
전기영동 결과, 추출한 DNA의 PCR 증폭산물이 예상한 크기의 단일 밴드로 관찰되었다. 이는 목표 유전자 부위가 성공적으로 증폭되었음을 의미한다. 또한 DNA 마커와 비교하여 증폭산물의 크기를 정확히 확인할 수 있었다.
추출한 DNA의 PCR 결과를 전기영동으로 확인한 이번 실험을 통해, 혈액으로부터 DNA를 안정적으로 분리하고 유전자 증폭에 성공했음을 검증할 수 있었다. 이는 향후 유전자 분석 및 진단 실험의 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.
1.2. 실험 이론 및 원리
1.2.1. PCR DNA 증폭 기술
PCR DNA 증폭 기술은 뮬리스에 의해 고안된 방법이다. 처음에는 대장균에서 분리한 DNA 중합효소 I을 사용하였으므로 사이클이 지날 때마다 효소를 첨가해야 하는 불편 때문에 널리 이용되지 않았다. 그러나 사이키가 높은 온도에서도 그 활성이 없어지지 않는 Taq DNA 중합효소를 발견한 후 실험방법이 보편화되었다.
PCR은 증폭시키려 하는 주형(template) DNA와 함께 우리가 증폭시키고자 하는 특정 지역에 결합하는 프라이머(primer)와 DNA 중합효소, 새로운 DNA를 만들기 위한 재료인 dNTP를 함께 집어 넣어 준다. 이후 94∼96℃ 정도로 열을 가하면 한 개의 DNA가 두 가닥으로 분리되고, 온도를 50∼64℃ 정도로 내리면 프라이머와 중합효소가 외가닥 DNA의 특정 부위에 결합하여 2개의 DNA가 된다. 이것이 1주기가 되며 다시 온도를 올려서 이 과정을 반복하면 4개, 8개, 16개가 되는 식으로 폭발적인 연쇄 작용을 통해 원하는 DNA의 양이 늘어나게 된다.
프라이머란 DNA 중합효소가 붙어서 DNA 합성을 개시할 수 있는 15∼50 염기쌍(base pair) 정도의 올리고뉴클레오티드를 말한다. DNA 중합효소는 DNA를 합성할 수 있는 효소로서, 초기에는 대장균의 DNA 중합효소를 사용했으나 고온, 저온을 왕복하는 과정 때문에 고온에서 DNA 중합효소가 변형되어 매번 새로 넣어 줘야 하는 불편함이 있었다. 이를 개선하여 호열성 세균인 테르무스 아쿠아티쿠스에서 얻은 Taq 중합효소를 이용하여 변형 문제를 해결하였다. 그러나 Taq 중합효소는 DNA 중합에 오류가 빈번히 일어난다는 문제가 있기 때문에, 현재는 고세균 피로코쿠스 푸리오수스에서 얻은 Pfu 중합효소와 Taq 중합효소를 혼합하여 PCR법에 주로 이용하고 있으며 다른 중합효소도 널리 이용된다.
PCR법은 현재 생물학에서 쓰이지 않는 곳이 없다고 해도 과언이 아닐 정도로 광범위하게 사용되는 기술이다. 또한 근래 과학 수사나 친자 감별 등에 자주 이용되는 DNA 지문 분석 역시 PCR법을 이용해서 이루어진다. 생물학에서는 여러 유전병을 판별하기 위해서 인간 유전학에서 사용하는 경우가 있으며, 오래된 고생물이나 멸종 생물의 희소 DNA를 증폭하기 위해서도 이용된다. 분류학에서도 종 간의 DNA 비교를 위해 PCR법을 널리 이용하고 있으며, 분자생물학에서는 DNA나 RNA를 다루기 위해서 반드시 이용되는 매우 중요한 기술로 받아들여지고 있다. 이처럼 PCR DNA 증폭 기술은 생명과학 분야에 광범위하게 활용되며, 특히 그 중요성과 유용성이 지속적으로 발전하고 있다.
1.2.2. PCR 원리와 과정
증폭시키려 하는 주형(template) DNA와 함께 우리가 증폭시키고자 하는 특정 지역에 결합하는 프라이머(primer)와 DNA 중합효소, 새로운 DNA를 만들기 위한 재료인 dNTP를 함께 준다. 이제 94∼96℃ 정도로 열을 가하면 한 개의 DNA가 두 가닥으로 분리된다. 이후 온도를 50∼64℃ 정도로 내리면 프라이머와 중합효소가 외가닥 DNA의 특정 부위에 결합하고, 다음에 합성되어 2개의 DNA가 된다. 이것이 1주기가 되며 다시 온도를 올려서 이 과정을 반복하면 4개, 8개, 16개가 되는 식으로 폭발적인 연쇄 작용을 통해 원하는 DNA의 양이 늘어나게 된다. 여기서 프라이머란 DNA 중합효소가 붙어서 DNA 합성을 개시할 수 있는 15∼50 염기쌍(base pair) 정도의 올리고뉴클레오티드를 말하며, DNA 중합효소는 DNA를 합성할 수 있는 효소로서, 개발 초기에는 대장균의 DNA 중합효소를 사용했으나 고온, 저온을 왕복하는 과정 때문에 고온에서 DNA 중합효소가 변형되어 매번 새로 넣어 줘야 하는 불편함이 있었다. 이를 개선하여 호열성 세균인 테르무스 아쿠아티쿠스에서 얻은 Taq 중합효소를 이용하여 변형 문제를 해결하였다. 하지만 Taq 중합효소는 DNA 중합에 오류가 빈번히 일어나는 문제가 있기 때문에, 현재는 고세균 피로코쿠스 푸리오수스에서 얻은 Pfu 중합효소와 Taq 중합효소를 혼합하여 PCR법에 주로 이용하고 있으며 다른 중합효소도 널리 이용된다. PCR Product는 DNA 중에서 목적하는 일부분만을 특정 효소를 이용하여 대량으로 복사하여 만든, 즉 PCR 과정을 거친 산물이다. 이를 통해 증폭된 산물은 전기영동을 통해 크기별로 분리할 수 있고, 이를 통해 증폭 산물의 크기를 측정할 수 있다. 이렇듯 PCR법은 고도의 정확성과 신뢰성으로 생물학 전반에 걸...
