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1. BCA 분석법을 이용한 단백질 정량
1.1. BCA 분석법의 원리
BCA 분석법의 원리는 다음과 같다. BCA 분석법은 Lowry 법을 개량한 방법으로, Folin 시약 대신 BCA(bicinchoninic acid) 시약을 사용하는 비색법이다. 먼저 단백질은 알칼리 환경에서 구리 이온(Cu2+)과 반응하여 청색의 착화합물을 형성한다. 그 다음 BCA 시약에 들어있는 두 분자의 BCA가 단백질에 의해 환원된 구리 이온(Cu+)과 결합하여 보라색의 복합체를 만든다. 이 BCA-구리 복합체의 농도는 시료 내 단백질의 농도에 비례하므로, 이 복합체의 562nm에서의 흡광도를 측정함으로써 시료 내 단백질의 농도를 정량할 수 있다. 따라서 이미 농도를 알고 있는 표준 단백질을 BCA 시약과 반응시켜 562nm에서의 흡광도를 측정하고, 이를 토대로 작성한 표준 곡선에 미지 시료의 흡광도를 대입하면 시료의 단백질 농도를 추정할 수 있다. 이처럼 BCA 분석법은 단백질 복합체의 형성과 이에 따른 흡광도 변화를 측정하여 단백질 농도를 정량적으로 분석할 수 있는 방법이다.
1.2. BCA 분석법을 위한 실험 준비
단백질을 포함하고 있는 시료를 분석하기 위해서는 필요한 실험 도구와 시약을 준비해야 한다. 우선 단백질 표준 용액으로 사용할 Bovine Serum Albumin (BSA)을 준비한다. BSA 2mg/mL 농도의 stock 용액에서 희석 단계를 거쳐 0, 0.025, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2mg/mL의 서로 다른 농도의 표준용액을 만든다.
BCA 시약은 Reagent A와 Reagent B를 50:1의 비율로 섞어 Working Reagent를 제조한다. 실험에 필요한 BCA Working Reagent의 총량은 (표준용액 수 + 미지시료 수) × 반복 수 × well당 부피이므로, 계산 결과 4.8mL의 Working Reagent가 필요하다. 이를 위해 Reagent A 5mL와 Reagent B 100μL를 섞는다.
실험을 위한 기구로는 96-well microplate, micropipette과 tip, 1.5mL 튜브, tissue, 70% 에탄올, 37°C incubator, plate reader 등이 준비된다.
실험 준비 과정에서 주의할 점은 각 용액의 농도와 위치를 확실히 숙지하고, 피펫 팁을 지속적으로 교체하여 오염을 방지하는 것이다. 또한 Working Reagent를 분주할 때는 gently pipetting을 하여 기포가 생기지 않도록 한다.
1.3. 단백질 표준 용액 제조
2㎎/㎖ 농도의 BSA(bovine serum albumin) 단백질 stock 용액을 제공받았다. 이를 이용하여 7개의 농도(0, 0.025, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2㎎/㎖)의 단백질 표준 용액을 serial dilution 기법을 통해 준비한다. 우선 2㎎/㎖ BSA 용액 80㎕를 취하여 separate tube에 옮긴다. 그 다음 2㎎/㎖ BSA 용액 30㎕와 증류수 50㎕를 섞어 1㎎/㎖ BSA 용액 60㎕를 제조한다. 1㎎/㎖ BSA 용액 40㎕와 증류수 40㎕를 섞어 0.5㎎/㎕ BSA 용액 40㎕를 만든다. 이와 유사한 방식으로 0.25㎎/㎖, 0.125㎎/㎖, 0.025㎎/㎖ 농도의 BSA 용액을 순차적으로 제조한다. 마지막으로 증류수 40㎕를 취하여 0㎎/㎖ 농도의 blank 용액을 준비한다. 이러한 일련의 단계를 거쳐 총 7개의 농도 범위에 걸친 단백질 표준 용액을 확보할 수 있다. 단백질 표준 용액 제조 시 정확한 농도와 균일성을 위해 충분한 pipetting을 통해 각 용액을 잘 섞는 것이 중요하다.
1.4. BCA 시약 제조
BCA 분석법을 위해서는 BCA 시약을 제조해야 한다. BCA 시약은 BCA 시약 A와 BCA 시약 B를 50 : 1의 비율로 혼합하여 만든다. BCA 시약 A는 주요 성분인 sodium carbonate, sodium bicarbonate, bicinchoninic acid가 포함되어 있고, BCA 시약 B는 구리(II) 황산염이 주성분이다. 필요한 총 BCA 시약의 양은 표준 단백질의 개수와 미지 시료의 개수, 그리고 각 well 당 200μL씩 분주하는 것을 고려하여 계...
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