본문내용
1. 단백질 정량 분석 - BCA법 & SDS-PAGE 분석 & Western Blot
1.1. 실험 목적
BCA 분석법을 이용한 단백질 정량 분석
실험 목적은 BCA 법을 활용하여 우유 중의 단백질 함량을 분석하고, SDS-PAGE와 Coomassie Blue 염색을 통해 단백질의 전기영동 결과를 관찰한 것을 바탕으로 Western Blot을 시행하여 membrane에 transfer시켜 항원-항체 반응을 이용하여 특정한 단백질의 정량 분석과 검출하는 방법을 실험을 통해 숙지하는 것이다.
BCA 분석법은 단백질이 구리 이온(Cu2+, Cu+)을 환원시킬 수 있는 성질을 이용한다. 단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA용액과 반응하여 보라색 화합물을 생성하며, 이 화합물은 562㎚ 영역에서 구리 이온이 담긴 용액과 BCA용액 각각보다 빛의 흡수율이 높아 분광광도계로 측정하면 단백질 농도를 알 수 있다. 단백질의 양이 많을수록 보라색 화합물이 많이 생성되어 흡수율이 증가하며, 이에 비례하여 샘플 내 단백질 양을 결정할 수 있다.
SDS-PAGE는 단백질의 구조를 선형으로 만들어 분자량에 따라 분리하는 방법이다. SDS는 단백질의 1차 구조를 변성시켜 음전하를 띄게 하며, polyacrylamide gel을 이용한 전기영동으로 단백질을 분자량 별로 분리할 수 있다. 이를 통해 목적하는 단백질의 분자량을 확인할 수 있다.
Western Blot은 SDS-PAGE로 분리한 단백질을 membrane에 transfer하여 항원-항체 반응을 이용해 특정 단백질을 검출하는 방법이다. 항체의 특이성을 이용하여 전체 단백질 중 원하는 단백질만을 선택적으로 검출할 수 있다. 단백질 추출, 정량, SDS-PAGE, 전기 transfer, 항원-항체 반응, 검출 등의 단계로 이루어진다.
제공된 문서에 따르면 실험에 사용된 기구와 시약은 다음과 같다. 단백질 정량분석-BCA법에는 분광광도계, 마이크로플레이트 리더, 큐벳, 피펫, 원심분리기 등이 사용되었고, BCA 분석 kit의 Reagent A와 Reagent B가 사용되었다. SDS-PAGE 분석에는 전기영동 장치, 아크릴아마이드, 완충용액, 단백질 ladder 등이 사용되었다. Western Blot에는 transfer 장치, 니트로셀룰로오스 membrane, 1차·2차 항체, 발색 reagent 등이 사용되었다.
실험 방법은 다음과 같다. 단백질 정량분석-BCA법에서는 우유 시료와 표준 농도의 BSA 용액을 준비하고, BCA 시약과 반응시킨 후 분광광도계 또는 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하여 검량선을 작성하고 우유 시료의 단백질 농도를 산출하였다. SDS-PAGE 분석에서는 대장균 시료를 SDS로 변성시킨 후 전기영동하고 Coomassie Blue 염색으로 단백질 밴드를 관찰하였다. Western Blot에서는 SDS-PAGE로 분리한 단백질을 membrane에 transfer하고 1차, 2차 항체 반응 및 발색 반응을 거쳐 특정 단백질을 검출하였다.
실험 결과, BCA 법을 통해 우유 중 단백질 농도가 약 34.5㎎/㎖(3.45%)로 측정되었다. SDS-PAGE 결과 IPTG 처리에 따른 GST 단백질의 발현 양상이 관찰되었다. 그러나 Western Blot 실험에서는 목표 단백질인 GST가 검출되지 않고 비특이적인 반응만 관찰되어 실험이 실패한 것으로 보인다.
토의 사항으로는, BCA 법의 경우 단백질 농도에 따른 흡광도 변화가 잘 나타나 정량 분석에 유용하지만 일부 환원제, 산화제, EDTA 등 물질에 의해 영향을 받을 수 있다는 점을 고려해야 한다. SDS-PAGE 실험에서 BL21(pGEX-4T) 균주에서 IPTG 처리에 따른 GST 단백질 발현이 확인되었으나, Western Blot 실험에서 GST 검출에 실패한 것은 transfer 효율 저하, 항체 반응 조건 최적화 실패 등의 이유가 있었을 것으로 추정된다. 향후 실험 결과의 재현성을 높이기 위해서는 각 단계별 변수를 면밀히 검토하고 최적화하는 등의 노력이 필요할 것으로 보인다.
1.2. 실험 이론 및 원리
1.2.1. 단백질 정량법
단백질은 구리 이온(Cu^{2+}, Cu^{+})을 환원할 수 있는 성질을 이용하여 정량할 수 있다. 단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA용액과 반응하여 보라색의 화합물을 생성한다. 이 화합물은 빛의 특정 영역(562㎚)에서 구리 이온이 담긴 용액과 BCA용액 각각보다 빛의 흡수율이 높기 때문에, spectrophotometer를 사용하여 측정하면 흡수율 차이를 통해 단백질의 양을 알 수 있다. 단백질의 양이 많을수록 보라색 화합물이 더 많이 생성되며, 이에 따라 빛을 더 많이 흡수하게 된다. 따라서 흡수율 증가와 단백질 양은 비례한다. 단백질 농도에 따른 흡수율 데이터가 있어야 이 방법을 통해 시료의 단백질 양을 정량할 수 있다.
BCA 분석법은 단일 시약을 사용하여 방법이 간단하고 최종 시료의 안정성이 높아 온도 범위가 넓다는 장점이 있다. Lowry 분석법에 비해 방해 물질의 영향이 적다. 그러나 반응 속도가 느리고 단백질이 변성될 수 있다는 단점이 있다. 측정 범위는 Standard Assay의 경우 10~1200μg/㎖, Micro-assay의 경우 0.5~10μg/㎖이다.
환원제나 산화제, EDTA, 아미노산 등은 BCA 분석 시 오차를 유발할 수 있다. 온도는 37℃일 때 가장 높은 흡광도를 나타내며, pH는 11.25에서 구리 이온이 가장 잘 환원된다. 이러한 요인들을 고려하여 BCA 분석법을 정확하게 수행해야 한다.
1.2.2. SDS-PAGE 분석
SDS-PAGE 분석이다. SDS(Sodium dodecyl sulfate)는 단백질이나 핵산의 구조를 깨뜨려 선형으로 만드는 역할을 한다. PAGE(poly acrylamide gel electrophoresis)는 acrylamide의 중합반응으로 만들어진 gel을 이용한 전기영동법이다. SDS-PAGE는 단백질이나 핵산의 구조를 깨뜨려 선형으로 만든 뒤 acrylamide gel을 이용하여 전기영동하는 것이다. 전기영동은 질량뿐 아니라 분자의 구조에 따라서도 밴드의 위치가 달라지므로, 단백질을 모두 선형으로 만들어 본래의 구조에 관계없이 순수하게 질량에만 따라서 나열되게 하여 목적으로 하는 분자를 찾는 방법이다. 하지만 단백질이 선형이 되어 본래의 기능이 상실되므로 원하는 단백질만을 염색하여 나타나게 할 수는 없다. 만약 특수염색으로 원하는 단백질만을 염색하고 확인하려 할 때는 SDS를 제외한 PAGE만을 하여 단백질의 본래의 형태를 유지시켜야 한다. SDS-PAGE에서는 10% SDS(Sodium dodecyl sulfate) sol'n이 사용되는데, 이는 생화학분야에서 가장 많이 사용되는 계면활성...
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