소개글
"일반생물학 실험 플라스미드 DNA 추출"에 대한 내용입니다.
목차
1. 플라스미드 DNA 추출
1.1. 실험 목적
1.2. 실험 이론 및 원리
1.2.1. DNA Mini prep
1.2.2. Alkaline lysis (denaturation) method
1.2.3. Plasmid DNA
1.2.4. Plasmid DNA 분리 정제
1.2.4.1. CsCl/EtBr Equilibrium Centrifugation
1.2.4.2. Boiling method
1.2.4.3. Alkaline lysis method
1.3. 실험 기구 및 시약
1.4. 실험 방법
1.5. 실험 결과 및 토의
1.5.1. 실험 고찰
1.6. 참고 문헌
2. Recombinant DNA plasmid 추출
2.1. 실험 목적
2.2. 실험 이론 및 원리
2.2.1. 실험 요약
2.2.2. Alkaline Lysis
2.3. 실험 방법
2.4. 실험 결과 및 토의
2.4.1. 실험 고찰
2.4.1.1. Miniprep 각 buffer의 기능
2.4.1.2. Plasmid DNA와 chromosomal DNA의 차이
2.4.1.3. Cloning 과정
2.4.1.4. DNA 추출 확인 방법
2.4.1.5. Alkaline Lysis 외 miniprep 방법
3. 참고 문헌
본문내용
1. 플라스미드 DNA 추출
1.1. 실험 목적
'플라스미드 DNA 추출' 실험의 목적은 Alkaline lysis (denaturation) method에 대해 알아보고, 이 방법을 통해 플라스미드 DNA를 추출해보는 것이다.
즉, 이 실험을 통해 플라스미드 DNA를 추출하는 대표적인 방법인 Alkaline lysis 방법의 원리와 특성을 이해하고, 실제로 이 방법을 적용하여 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 분리해내는 것을 목적으로 한다.
1.2. 실험 이론 및 원리
1.2.1. DNA Mini prep
DNA Mini prep은 말 그대로 "DNA 소량 추출"을 의미한다. 이는 세균으로부터 소량의 플라스미드 DNA를 분리하는 방법이다.
DNA Mini prep 방법은 주로 플라스미드 DNA를 소량으로 추출할 때 사용되는데, 전체 DNA 중에서 플라스미드 DNA만을 선별적으로 분리해낼 수 있는 특징이 있다. 세균 내에는 염색체 DNA와 플라스미드 DNA가 함께 존재하는데, 이 둘의 물리적 특성 차이를 이용하여 플라스미드 DNA만을 분리해낼 수 있다.
염색체 DNA는 세균 내에서 복잡한 구조로 존재하지만, 플라스미드 DNA는 작고 단순한 고리 구조를 가지고 있다. 이러한 차이로 인해 세포를 alkaline 용액으로 처리하면 플라스미드 DNA는 상대적으로 안정한 상태를 유지할 수 있다. 반면 염색체 DNA는 변성되어 침전된다. 이후 중화 과정을 거치면 플라스미드 DNA가 선별적으로 상층액에 남게 되어 이를 분리할 수 있게 된다.
이처럼 DNA Mini prep은 플라스미드 DNA만을 효과적으로 분리할 수 있는 장점이 있어, 분자생물학 연구에서 널리 활용되고 있다. 특히 소량의 플라스미드 DNA를 필요로 하는 실험에서 유용하게 사용된다.
1.2.2. Alkaline lysis (denaturation) method
Alkaline lysis (denaturation) method는 소량의 플라스미드 DNA를 분리하는 데 가장 많이 사용하는 플라스미드 DNA 분리 방법이다. 이 방법은 Buffer에 의해 만들어지는 pH 환경을 이용하여 세균의 세포벽과 세포막을 파괴시킨 뒤 원심분리를 함으로써 플라스미드 DNA의 특성을 이용하여 전체 DNA로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 방법이다.
플라스미드 DNA를 분리하는데 사용되는 버퍼의 역할과 염색체 DNA에 비해 크기가 매우 작고 pH 변화에 의한 영향을 덜 받는다는 점이 매우 중요하게 작용한다. 우선 Resuspension Buffer에는 50 mM의 glucose, 25 mM의 Tris-Cl(pH 8.0), 10 mM의 EDTA(pH 8.0)가 포함되어 있다. Tris-Cl은 pH를 맞추기 위한 것이고 EDTA는 세포벽을 유지하는데 필요한 Ca2+를 제거하여 세포벽이 무너지게 한다. Glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지하게 한다.
다음으로 Lysis Buffer는 0.2 N NaOH와 1% SDS를 포함하고 있다. SDS는 계면활성제로서 세포를 용균시키고, NaOH는 DNA가 깨진 세포 밖으로 나왔을 때 그 DNA를 변성시킨다.
마지막으로 Neutralization Buffer는 5 M potassium acetate와 glacial acetic acid를 포함하고 있다. Acetate는 강력한 산으로서 NaOH에 의해 염기성이 된 용액을 중화시켜 DNA가 재결합되도록 한다. pH를 급격히 7.0으로 복구시키면 크기가 작고 supercoiled된 플라스미드 DNA는 비교적 재결합이 잘 되지만 염색체 DNA는 잘 되지 않고 엉기게 된다. 이를 원심분리하면 염색체 DNA는 침전되고 상층액에 플라스미드 DNA만 남게 된다.
이처럼 Alkaline lysis 방법은 플라스미드 DNA의 특성을 이용하여 효과적으로 플라스미드 DNA를 분리해낼 수 있는 방법이다. 염색체 DNA와 구분되는 플라스미드 DNA의 작은 크기와 supercoiled 구조는 이 방법의 핵심적인 원리가 된다.
1.2.3. Plasmid DNA
플라스미드 DNA는 세균과 같은 원핵생물의 세포 내 염색체와 별개로 독립적으로 존재하는 원형의 이중나선 DNA 분자이다. 일반적으로 플라스미드는 세균의 생장이나 생존에 필수적이지는 않다.
플라스미드는 염색체보다 작으며 복제개시점을 갖고 있기 때문에 염색체와는 독립적으로 복제할 수 있다. 또한 플라스미드가 갖고 있는 몇몇 유전자는 세균과 같은 숙주세포의 특성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어 P-플라스미드는 페니실린을 포함한 여러 항생제에 대한 내성을 갖게 하는 유전자를 가지고 있어 P-플라스미드를 가진 Pseudomonas라는 세균 또한 여러 항생제에 대한 내성을 가지게 된다.
플라스미드는 기능에 따라 다양한 종류가 존재하며 크게는 플라스미드 자신이 한 세균에서 다른 세균으로 이동할 수 있는 전이성을 갖는 접합성 플라스미드와 비접합성 플라스미드로 분류할 수 있다. 세균 내에는 많은 종류의 플라스미드가 존재할 수 있으나 같은 종류의 플라스미드가 한 세균 내 존재할 수 없는 불화합성(incompatibility)을 ...
참고 자료
알기 쉽고 재미있는 분자생물학 4판. n.p.: (주)라이프 사이언스. David P. Clark, Lonnie D. Russell. 2013.이다. 이 문헌은 플라스미드 DNA 추출 실험에 대한 기본적인 이론과 원리를 설명하고 있다. DNA mini prep의 개념, alkaline lysis 방법을 통한 플라스미드 DNA 추출 과정, 플라스미드의 특성과 분리 정제 방법 등에 대해 상세하게 다루고 있다. 특히 alkaline lysis 방법의 각 buffer 역할과 플라스미드 DNA와 염색체 DNA의 차이점 등을 잘 설명하고 있어 본 실험의 이해를 돕는데 유용한 참고문헌이다.알기 쉽고 재미있는 분자생물학 4판. n.p.: (주)라이프 사이언스. David P. Clark, Lonnie D. Russell. 2013.
Purves, Life The Science of Biology, 7th Edition, Freeman, 2007, p.312-313
Campbell, Biology, 8th Edition, Pearson, 2008, p. 399
