competent cell preparation

소개글

이번 실험의 목표는 저번 주에 만든 E.coli plate에서 single colony를 따서 이를 competent cell로 만드는 것이다. competent cell은 세포막을 약하게 하여 DNA가 세포 속으로 들어가기 용이하도록 제조된 cell로, 이 실험은 앞으로 수행할 재조합 DNA의 형질전환을 위한 competent E.coli cell preparation이다. 먼저 E. coli를 LB petri dish에 streaking한 후, single colony를 LB broth에 inoculation한 후 배양한 다음, 자란 cell을 다시 1 % 계대하여 log phase 초기가 될 때까지, O.D. 값이 약 0.4~0.5가 될 때까지 키운다. 그리고 cell을 침전시킨 후, 차가운 CaCl 용액 에 부유시키고 다시 원심분리를 통해 cell을 침전시키고 앞과 같은 방법으로 부유시키는 데, 여기에 30 % glycerol과 CaCl를 같은 양으로 넣어주어 glycerol을 1/2 희석시킨다. 이 부유 액은 e-tube에 분주하여 원래는 액체 질소에 급랭시키는 것이 좋지만, 이번엔 생략하고 deep freezer속에 -80 ℃에 보관한다. 이러한 과정들은 속히 진행되어야 cell이 competence를 잃지 않게 되므로 실험에 주의를 기울여야 한다.

목차

abstract
introduction
method
result
discussion
references

본문내용

이번 실험의 목표는 저번 주에 만든 E.coli plate에서 single colony를 따서 이를 competent cell로 만드는 것이다. competent cell은 세포막을 약하게 하여 DNA가 세포 속으로 들어가기 용이하도록 제조된 cell로, 이 실험은 앞으로 수행할 재조합 DNA의 형질전환을 위한 competent E.coli cell preparation이다. 먼저 E. coli를 LB petri dish에 streaking한 후, single colony를 LB broth에 inoculation한 후 배양한 다음, 자란 cell을 다시 1 % 계대하여 log phase 초기가 될 때까지, O.D. 값이 약 0.4~0.5가 될 때까지 키운다. 그리고 cell을 침전시킨 후, 차가운 CaCl 용액 에 부유시키고 다시 원심분리를 통해 cell을 침전시키고 앞과 같은 방법으로 부유시키는 데, 여기에 30 % glycerol과 CaCl를 같은 양으로 넣어주어 glycerol을 1/2 희석시킨다. 이 부유 액은 e-tube에 분주하여 원래는 액체 질소에 급랭시키는 것이 좋지만, 이번엔 생략하고 deep freezer속에 -80 ℃에 보관한다. 이러한 과정들은 속히 진행되어야 cell이 competence를 잃지 않게 되므로 실험에 주의를 기울여야 한다. 그리고 우리가 사용한 competent cell 제조 방법은 차가운 CaCl 용액을 이용한 것인데 이 밖에 electroporation이라는 순간적으로 고압의 전류를 흐르게 하여 competence를 일으키는 더 효율이 좋은 방법이 있다. 그러나 주로 전자의 방법이 많이 쓰인다. 실험적으로 이러한 방법이 유효하다는 것이 관찰되었으며 이에 대한 이해는 세포막이 (-) charge를 띄고 DNA가 (-)charge를 띄어 둘 사이엔 척력이 작용하는 데, 이 때 Ca가 이 charge들을 잡아주어 DNA가 통과하기 수월하게 세포막의 balance가 흐트러지게 된다고 생각되고 있다. 또한 차갑게 사용하는 이유는 세포막을 응고시켜서 balance가 흐트러진 채 유지하기 위함으로 더 효율적이기 때문이라고 알려져 있다.

참고 자료

한국분자생물학회, 분자생물학, 아카데미 서적, 1997, p 513
Geoffrey M. Cooper, 세포학-분자학적 접근, 한우리, 2000, p125
Michael T. Madigan, 대학미생물학, 탐구당, 1999, pp 676~679
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