단백질 분리 및 정제 보고서

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목차

Ⅰ. [Day 1] Protein sample 및 Acrylamide Gel 제작3
1. Purpose3
2. Principles3-4
3. Material & apparatus 5
4. Procedure5

Ⅱ. [Day 2] Electrophoresis와 Primary antibody6
1. Purpose6
2. Principles6-7
3. Material & apparatus 8
4. Procedure8

Ⅲ. [Day 3] Secondary antibody와 ECL treatment 8
1. Purpose8
2. Principles8-9
3. Material & apparatus 9
4. Procedure9

Ⅳ. [Results]10-12

Ⅴ. [Discussion] 13

본문내용

1. Purpose
A. 10% Acrylamide gel을 제작한다.
B. C57BLKS쥐에서 extracted된 protein을 bradford assay를 통해 정량 한 후 protein sample을 제작한다.

2. Principles
2.1 Western blotting(immunoblotting)
Western blotting은 혼합물에서 특정한 단백질을 확인하기 위해 사용되는 정성 분석 방법으로 immunoblotting이라고도 한다. Western blotting을 통해 생물체 내에서 특정한 단백질이 얼마나 발현되었는지, 또한 특정 단백질이 어느정도 활성화 되었는지를 비교할 수 있다. Western blotting에서 사용되는 gel은 acrylamide로 만들어진 gel 이다. Acrylamide는 monomer를 물에 녹이면 긴 가닥의 polyacrylamide가 생성된다. Polyacrylamide가 생성되면 용액의 점성이 높아 지는데, 이 때 radical인 ammonium persulfate(APS)와 촉매 역할을 하는 TEMED(N, N, N', N'- tetramethylethylenediamine)를 넣어 주면 아크릴아마이드 고분자들끼리 서로 묶여 젤 형태로 굳는다. 아크릴아마이드와 비스아크릴아마이드를 이용해 gel의 pore의 크기를 조절 할 수 있다. 이렇게 만들어진 폴리아크릴아마이드 젤이 western blotting의 고정상으로 사용된다. 혼합물의 성분들은 gel 내에서 electrophoresis를 통해 분리 되는데 이 때 각 단백질의 size에 따라 protein-binding sheet로 이동하게 된다. 이 때 protein의 size 외에 다른 요인에 의해 gel 내에서의 이동 속도가 영향을 받지 않도록 하기 위해 단백질의 folding된 구조를 일정하게 통제해주어야 한다. 그래서 단백질 샘플을 SDS(sodium dodecyl sulfate)라는 detergent를 사용해 모든 folding된 구조를 깨뜨려 일정한 모양으로 만들어 준다.

참고 자료

Toltora, Funke, Case, (2013) Microbiology – An Introduction 11th international edition, PEARSON, p. 521
네이버 캐스트-화학 산책. 여인형. 2012. 아크릴아마이드.
http://navercast.naver.com/contents.nhn?rid=44&contents_id=7606
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네이버 지식백과-생명과학대사전. 2014. 단백질흡입법.
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=424204&cid=42411&categoryId=42411
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https://en.wikipedia.org/wiki/Leptin_receptor
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http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=425328&cid=42411&categoryId=42411
Wikipedia. 2016. Protein kinase B.
https://en.wikipedia.org/wiki/Protein_kinase_B