재결합 단백질의 발현/ Expression of recombinant proteins in E. coli

소개글

9.5/10 점 받은 생화학실험 보고서입니다.
깎인 이유와 교수님 피드백이 빨간 글씨로 들어있습니다.

목차

1. Summary
2. Introduction
3. Material and Methods
4. Result and Discussion
5. Reference

본문내용

1) GST-tagged Proteins

glutathione S-transferase (GST), histidine (HIS), 기타 친화성 태그를 이용하여 단백질을 정제하게 되면 기존에 잘 알려진 생화학적 특성을 가진 단백질과 알려지지 않은 생화학적 특성을 가진 단백질의 정제를 가능하게 도와준다. 따라서 이런 방법은 잘 알려지지 않은 단백질의 생물학적 기능을 연구하기 위한 도구로 사용되고 있다. GST는 211개의 아미노산 단백질로 이루어졌으며 분자량은 26 kDa이다. DNA 서열 재조합 단백질의 생산을 위한 발현 벡터를 정제하기 위해 사용된다. GST 단백질은 번역 시에 안정적이고 가용성이 높은 단백질로 빠르게 접히기 때문에, GST 태그를 포함하면 태그가 없을 때보다 더 잘 발현하고 용해도를 촉진하는 경우가 많다. 또한, GST 태그가 부착된 융합 단백질은 효소인 GST가 그 기질인 glutathione (GSH)과 결합하는 능력에 따라 정제되거나 검출될 수 있다. 이러한 태그는 재조합 단백질의 N 말단에 결합하게 된다. GST가 태그된 단백질은 친화성에 의해 박테리아 용해물로부터 쉽게 정제된다. 결합은 TBS, pH 7.5와 같은 조건에서 거의 중성에 가까운 완충액, 즉 생리학적인 조건과 맞물릴 때 가장 효과적이다. 결합은 GST의 필수 구조와 효소 기능을 보존하는 것에 달려 있기 때문에 단백질 변성제와 호환하여 사용하지 않는다.

2) 세포 파쇄

세포 내에 목표 생성물이 있다면 세포를 메디아에서 분리한 뒤 세포 내 생성물을 분리하기 위해 세포를 파쇄해야 한다. 세포를 파괴하는 방법에는 여러 종류가 있는데, 기계적인 방법과 비기계적인 방법이 있다.

<중 략>

BSA 표준 용액을 이용하여 그래프를 그리면 다음과 같은 일차함수 식이 만들어진다.
R 제곱 값이 1에 가까울수록 정확한 BSA 양이 들어갔다는 것을 의미한다.

y= 0.0522x + 0.0081 라는 일차함수 식에 y에 sample 흡광도 값을 입력하여 농도인 x 값을 구하면 된다.

sample의 양을 5 μL를 넣었기 때문에 농도를 구하기 위해선 5로 x 값을 나누어주면 농도인 μg/μL 값을 구할 수 있다.

참고 자료

Cytiva. (GST) gene fusion system. GST tagged protein. 2023-12-08.
https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-11873-pdf
Thermofisher. GST-tagged Proteins – Production and Purification. GST tagged Protein. 2023-12-08. https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/gst-tagged-proteins-production-purification.html
화학공학연구정보센터. 3세포파쇄. sonication. 2022-12-08.
https://www.cheric.org/files/education/cyberlecture/e200803/e200803-301.pdf
BIOLOGICS international Corp. IPTG Induction Theory. IPTG 원리. 2022-12-08
https://www.biologicscorp.com/blog/iptg-induction-protein-expression/