competent cell, PCR, 전기영동

소개글

"competent cell, PCR, 전기영동"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Intro
3. Materials and Methods
4. Result
5. Discussion
6. References

본문내용

1. Abstract
본 실험에서는 본격적인 실험에 앞서 LB broth와 LB agar plate를 만든다. 이는, 배지나 멸균, 시약 제조 방법에 대해 기본 지식을 습득하기 위함이다. 실험에서 사용한 LB broth는 tryptone, yeast extract, NaCl을 넣어 만들고 LB agar plate는 이 LB broth에 agar를 넣어 고체화한 것이다. 다음으로 Competent cell을 제조한다. 형질 전환의 개념과 형질 전환 효율 계산법을 이해하고 competent cell의 의미와 제조법을 이해하기 위한 과정이다. Competent cell은 LB plate에 streaking해서 키운 DH5α의 colony 한 개를 따서 LB broth에 접종하고 배양한 뒤 그 중 일부를 다시 LB flask에 접종해 배양한다. 원심분리해 세포만 침전시켜 CaCl2와 glycerol로 풀어줘 만든다. 만든 competent cell을 plasmid DNA와 섞고 incubation한 뒤 heat shock 후 얼음에서 incubation한 뒤 LB plate에 spreading한다. 하루 밤 동안 37 ℃ incubator에서 배양하고 다음날 아침에 꺼내서 colony 수를 세 형질전환 효율을 계산한다. 그 다음은 소량의 DNA를 다량으로 증폭하기위해 PCR을 진행한다. Template, primer, dNTP, Taq polymerase, PCR buffer를 넣고 PCR 기계를 돌린다. PCR은 denaturation, annealing, extension과정이 약 25 cycle 돌아간다. PCR이 종료되면 전기영동과 DNA purification을 이해하기 위해 전기영동과 DNA purification을 진행한다. Agarose와 TAE buffer를 넣어 agarose gel을 만들고 PCR sample과 loading dye를 섞어 well에 loading한다. DNA ladder도 함께 loading한다. 전기영동이 후 UV lamp에서 band를 확인해 원하는 위치의 DNA band가 있는 gel을 잘라 GB buffer와 섞어 녹이고 NW buffer, elution buffer를 차례대로 column에 넣고 원심분리해 최종적으로 DNA를 얻는다.

참고 자료

T.A.Brown(2012), 유전자 클로닝과 DNA 분석, 제6판, 월드사이언스, pp.94-95, 111-113
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