western blot

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Bradford assay, SDS-PAGE & Transfer & Blocking, Western develop

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이 실험은 물질 M이 A549 cell에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험이다. A 549 cell에 물질 M을 처리하지 않은 것을 control, 100 μM처리한 것을 treatment로 사용했다. A549 cell은 폐에서 유래한 암세포이다.in vitro에서 배양시monolayer를 형성한다.
Western blot은 분자생물학, 면역학 등에서 추출물의 특정한 단백질을 검출하기 위해 사용하는 분석 방법이다. Immunoblot, protein blotting이라고도 불리며, 단백질의 발현 여부를 알아보는데 자주 사용된다. Western blot에서는 membrane에 있는 특정한 단백질을 확인하기 위하여 항체를 사용한다. 항원-항체반응의 특수성은 복잡한 단백질 혼합물 가운데서 target 단백질을 밝혀낼 수 있도록 한다. 본 실험은 인간의 암세포에 물질 M을 처리했을 때 나타나는 단백질 발현을 비교하기 위해 진행되었다.이 실험에서는 정확한 측정을 위해 단백질 정량을 먼저 진행했다.
단백질 정량을 위해 lysis buffer를 사용하고, Bradford assay를 진행했다. Lysis buffer는 분자생물학 실험에서 cell의 구성물을 분석할 목적으로 cell을 파괴하기 위해 사용되는 용액이다. 대부분의 lysis buffer는 산도와 용해물의 농도를 조절하기 위해 염을 포함하고 있다. Lysis buffer는 동물세포와 식물세포 모두 사용 가능하다. 이 중 LIPA buffer는 면역 침강과 cell, tissue에서 일반적으로 단백질을 추출할 때 자주 쓰이는 buffer이다. 대부분 단백질의 약한 결합을 붕괴시켜 cell에서 단백질을 분리한다.
Bradford assay는 염색약Coomassie Brilliant Blue G-250를 이용한 흡광도 차이를 이용한다. 산성 환경에서는 이 시약이 청색으로 변하고 단백질과 결합한다. 이 단백질-시약 복합체의 수는 단백질의 농도와 비례하므로 흡광도를 측정해 단백질의 농도를 알 수 있다.

참고 자료

위키백과, "웨스턴 블랏,
”https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%9B%A8%EC%8A%A4%ED%84%B4_%EB%B8%94%EB%9E%8F
wikipedia, ”western blot”, https://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot
https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/western-blot-transfer-methods.html
https://en.wikipedia.org/wiki/Lysis_buffer
위키백과,”브래드퍼드 단백질 정량법”
https://ko.wikipedia.org/wiki/%EB%B8%8C%EB%9E%98%EB%93%9C%ED%8D%BC%EB%93%9C_%EB%8B%A8%EB%B0%B1%EC%A7%88_%EC%A0%95%EB%9F%89%EB%B2%95
https://en.wikipedia.org/wiki/Polyacrylamide_gel_electrophoresis
https://info.gbiosciences.com/blog/enhanced-chemiluminescence-what-is-it
https://en.wikipedia.org/wiki/A549_cell
https://openwetware.org/wiki/SDS_sample_buffer
https://terms.naver.com/entry.nhn?docId=2691223&cid=42411&categoryId=42411

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