Real-Time PCR

소개글

Real-Time PCR 에 대한 설명과 구체적인 프로토콜을 담았습니다.
기존의 자료들은 교과서적은 설명만 나열되어 있다면, 이 자료에는 구체적인 프로토콜까지 같이 있으므로 실제 실험에도 많은 도움이 될 것으로 사료됩니다.

목차

1. Real Time PCR Protocol
2. Real Time PCR 부연설명

본문내용

1. Real Time PCR 이란?
Real Time PCR 은 잘 알려져 있는 PCR 기법을 개량한 것으로서, 증폭량을 실시간으로 모니터할 수 있는 방법이다. 이론상으로 PCR 산물은 반응당 2배씩 증가하므로 그 최종 증폭 산물의 양을 비교함으로써 target mRNA의 초기량을 추정하면 된다고 생각할 수 있지만 실제로는 샘플에 따라 상당히 불규칙적인 결과가 나온다. 예를 들어 PCR 증폭이 어느 사이클 이상의 횟수를 넘어가게 되면 초기의 시작 template 양과 상관없이 일정하게 포화가 되는 plateau 현상이 나타나는데, 이 때문에 수많은 시행착오를 거치지 않으면 신빙성있는 data를 얻을 수 없다.
따라서 Real Time PCR 방법에서는 DNA 에 결합하는 DNA-binding fluorophores (DNA에 결합하여 형광을 내는 물질인 SYBR green 등)나 형광물질이 붙어 있는 hyb probe, Taqman probe 또는 molecular becon 등을 이용해서 여러 개의 PCR 반응물의 양을 이들 형광물질의 변화량을 통해 실시간으로 모니터링할 수 있고, 시간대 별로 증가하는 반응물의 형광이 그래프로 나타날 때의 Ct값으로부터 초기 mRNA의 양을 정확하게 계산할 수 있다.
보통 real time PCR의 모니터는 형광시약을 사용하는 방법을 사용하는데, Smart Cycler® System을 사용하는 경우는, 여러 형광분석 방법 중 다음의 3가지 방법을 선택할 수 있다.

(1) Interchelating 법
Double strand DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약 (Interchelator : SYBR Green I, EtBr 등)을 반응계에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법이다. Polymerase반응으로 합성된 double strand DNA에 interchelator가 결합하면 형광을 나타내는데 이 형광강도를 검출하여 정량 뿐 아니라 증폭 DNA의 융해온도를 측정할 수 있다.

참고 자료

없음