Western blot

소개글

Western blot

목차

Ⅰ. Abstract
Ⅱ. Introduction
Ⅲ. Materials
Ⅳ. Chemical reagent & Apparatus
V. Methods
Ⅵ. Results
Ⅶ. Discussion
Ⅷ. Reference

본문내용

Ⅰ. Abstract
이번 실험은 한 학기의 마무리 실험으로써 우리가 추출해 내었던 단백질 중에서 크기별로 분리된 것을 확인하고 다시 한 번 원하는 단백질만 정확히 보기 위해 하는 실험이다. 각 조직에서 추출해 낸 단백질은 SDS-PAGE로 크기별로 분리가 되었으나 우리가 원하는 것만 선택적으로 하나의 band만 확인하는 실험인 것이다.
먼저 저번 시간에 단백질을 모두 membrane으로 옮겨놓았고 여기에 크기별로 모여 있는 단백질에서 우리가 원하는 HSP17.7를 따로 분리하기 위해 선택적으로 붙는 Antibody를 사용하였다. Antibody는 특이적인 반응을 하므로 원하는 것만 분리해 내기 좋은 원리이다. 먼저 옮겨 놓은 membrane에 blocking이라는 단계를 진행한다. protein이 없는 부분에 Antibody가 붙는 것을 방지하는 작업으로 꼭 진행해야 하는 절차이다. BSA나 탈지분유를 membrane에 부착하는데 이 단계를 하지 않으면 membrane이 검거나 얼룩이 진다고 한다. 그 후에 primary Antibody처리를 하는데 이 첫 번째 항체는 HSP17.7에 선택적으로 붙는 항체이다. 그 후는 secondary Antibody를 처리한다. 이 두 번째 항체는 첫 번째 항체를 인지하는 것으로 이 항체 꼬리에는 HRP라는 효소가 붙어져 있고 이것은 ECL이라는 기질과 붙어서 형광을 나타내는 것으로 나중에 HSP17.7을 발광하는 것으로써 확인할 수 있게 해주는 역할을 한다. AB2까지 처리하고 기질을 첨가한 후 X-ray 하에서 확인하는 과정이다.
우리는 모든 과정을 거친 membrane을 필름에 옮기고 develop과 fixer를 거친 후 발광해서 보이는 필름을 현상해 보았다. 각 조의 추출된 단백질이 한 번에 있었는데 우리 조에서 많은 단백질이 추출되어서 선명히 보이고 제일 양이 많은 것 같아서 기분이 좋았다. 매우 간단한 항원-항체 반응이 이렇게 좋은 실험 technique으로 사용되어지고, 또 교과서에서 많이 듣던 실험을 직접 하고 보게 되서 좋은 기회였다고 생각이 들었다.

참고 자료

1) http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/western_blot.php
2) http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot
3) 분자생물학 2판 / Robert F. Weaver / 라이프사이언스 / 2003. 2