PCR의 소개와 최적화 및 Carryover Contamination 문제해결, 특이도 및 민감도 향상 방법

소개글

PCR에서 기본적이지만 매우 중요한 부분을 다루고 있는 것으로, PCR의 소개와 함께 여러가지 방법들을 수록하고 있다.

목차

Ch1. Inroduction to PCR
Ch2. Optimization and troubleshooting in PCR
Ch3. Enzymatic Control of Carryover Contamination in PCR
Ch4. Specificity, Efficiency, and Fidelity of PCR

본문내용

Inroduction to PCR
1. Polymerase Chain Reaction ; PCR
(1) 특정 유전자 서열에 primer의 extension을 통한 반복적인 양방향적 DNA 합성을 말하는 PCR은 단순한 원리로 작동되지만, 표면적으로는 많은 문제들이 나타날 수 있다.
왜냐하면 PCR은 tube안에 수많은 각 반응물들을 섞어주고 machine으로 running하게 되는데, 실험실 내에서의 오염으로부터 안전한 상태에서 어떻게 PCR 과정의 set up과 protocol을 적용 할 수 있는 최선의 방법을 찾아야 하기 때문이다.
Clean한 PCR을 위해서는 어떻게 해야 하는지 기본적인 PCR 방법을 알아보고자 한다.
- standard PCR protocol (Taq DNA polymerase)
① 10x Enzyme­specific reaction Buffer
; 10~50 mM Tris­HCl, pH 7.5~9.0
6~50 mM KCl 또는 (NH4)2SO4
1.5~5.0 mM MgCl2 또는 MgSO4
② 0.2 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
③ 0.1~1.0 uM primer
④ 2.0~2.5 U DNA polymerase
⑤ Template DNA (102~105 copies)
⑥ DW 100 ul
(2) 상업적으로 판매되고 있는 thermostable DNA polymerase는 다양한 pH 조건들과 salt 농도를 갖고 있기 때문에 그에 맞는 buffer들을 사용해야 한다.
또한 PCR이 진행될 때는 thermal cycler에 의해 온도가 빠르게 변화하기 때문에 최종 reaction volume을 고려하여한다. 일반적으로 20 ul~100 ul로 한다. Large­volume의 sample은 가열과 냉각작용이 효과가 없을 것이고, small­volume은 분석하는데 있어 필요한 product가 부족하게 생성된다.
(3) PCR에 따른 3가지 단계
① Denaturation
- 92~96℃로 heating
- 시간은 Tube의 외형, thermal cycler, reaction volume에 따라 결정됨

참고 자료

없음