[유전공학] 박테리아(대장균)를 이용한 유전자 대량복제

소개글

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목차

1. 팹신의 개념,기능
2. gene의 선택
3. PCR 증폭
① PCR의 각 과정
(a) Denaturation
(b) Annealing
(c) Extension
3. cloning
4. transformation
5. selection

본문내용

4. transformation
E. coli는 세포벽과막의존재, 쉽게외래물질을받아들일수없다.
따라서 component cell을 준비해야한다.
heat shock 방법을 사용하기로한다.
calcium chloride와같은 salt 존재하에서 cold salt solution에 E. coli를 soaking
calcium chloride는 DNA를 cell 표면에더욱잘붙게한다.
하지만이것만으로는약하기때문에이 cell 표면에 DNA가붙은상태의 cell을 42℃에서 heat shock을준다.

6. selection

플라스미드를 uptake한 세포를 구별해야 할 필요가 있다. 이를 위해 selectable marker를 이용한다. Selectable marker란 비형질전환체(non-transformant)가 가지고 있지 않은 새로운 특징을 형질전환된 세포에 제공하는 유전자를 말한다. 대부분의 플라스미드 클로닝 벡터는 숙주세포에 항생제 저항성을 제공하는 적어도 하나의 유전자를 가지고 있다.
그러나 항생제에 대한 저항성은 단순히 플라스미드가 형질전환된 세포내에 존재하는 것에 달려있는 것이 아니라, 플라스미드의 저항성 유전자가 발현되어 항생제를 무독화시키는 효소가 합성되어야 한다. 저항성 유전자의 발현은 형질전환 직후에 시작되지만 항생제의 독성효과를 견디어 낼 만큼 충분한 효소를 보유하기 위해선 시간이 필요할 것이다. 이러한 이유로 형질전환된 세균을 heat-shock 처리 직후에 선별 배지(selective medium)에 플레이팅(plating)해서는 안되며 우선 항생제가 없는 배지에서 짧은 시간 동안 배양시켜야 한다. 그런 후에 형질전환된 세균이 플레이팅되어 항생제에 노출되었을 때 이들은 이미 생존할 수 있을 만큼 충분한 효소를 합성하고 있을 것이다. 이후 항생제가 들어간 배지에서 배양을 하면 숙주세포중에서 플라스미드가 들어간 것은 플라스미드의 항생제 저항 유전자 덕분에 살아남을 수 있지만 플라스미드가 들어가지 않은 숙주 세포는 항생제 저항 물질을 생산하지 못하기 때문에 죽게되어 selection 할 수 있게된다. 항생제 저항 유전자의 가운데에 insertion site가 존재하게되면 항생제 저항 유전자가 갈라지게되어 비활성화 된다. 따라서 항생제를 첨가한 배지에서 살 수 없게 된다.
이후 selection이 끝난 세포의 세포벽을 깨면 원하는 protein을 얻을 수 있다.

참고 자료

없음