DNA ligation & Transformation , Plasmid prep & restriction enzyme cut

소개글

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목차

1. Abstract
2. Intro
3. Materials and Methods
4. Data and Result
5. Discussion
6. References

본문내용

1. Abstract
본 실험은 이전 실험에서 제한효소처리해 얻은 insert DNA를 pET-21a(+) vector에 삽입하고 ampicillin 저항을 사용해 colony를 selection해 형질전환된 대장균으로부터 plasmid DNA를 추출하고 제한효소 처리해 전기영동 해 vector와 insert DNA를 분리하기 위한 실험이다. T4 DNA ligase는 T4 bacteriophage에서 유래하였고 DNA의 3’-OH와 5’-P 사이에 phosphodiester 결합을 형성해 ligation하는 효소다. Ligation의 buffer에는 ligase의 cofactor인 Mg2+를 제공하는 MgCl2와 ATP가 포함되어야 한다. 또한 환원 환경을 조성하는 DTT도 포함되어야 한다. Ligation이 일어날 때 한 분자의 DNA내에서 양 끝이 ligation되는 self-ligation이 일어나는데, 이를 방지하는 두 가지 효소로 양끝을 자르는 double-digestion 방식과 AP를 이용해 vector의 5’-end를 dephosphorylation 하는 방식이 있다. Ampicillin 저항 유전자를 가지는 vector를 사용하기 때문에 ampicillin으로 selection할 수 있다. 본 실험에서 사용하는 kit 방법은 manual prep과는 달리 column의 membrane과 plasmid DNA를 흡착하고 다시 얻는 방식이다. Renaturation 과정에서 guanidine hydrochloride, 고농도의 Na+가 들어가는데, 이는 silica membrane과 DNA사이에 bridge 역할을 해 membrane에 plasmid DNA를 흡착한다. 그 후 80 % EtOH이 포함된 wash buffer로 불순물을 제거하고 low salt, high pH인 elution buffer로 salt를 제거해 DNA를 elution한다. 본실험의 결과, vector only plate에서는 8개의 colony, vector-insert plate에서는 17개의 colony가 관찰된다. 이를 통ㅎ self-ligation을 완전하게 방지하지는 못했다고 생각했고 vector-insert의 colony 개수가 예상보다 적은 것은 competent cell의 문제가 있을 것이라고 판단했다.

참고 자료

Ukai H, Ukai-Tadenuma M, Ogiu T, Tsuji H. A new technique to prevent self-ligation of DNA. J Biotechnol. 2002 Aug 28;97(3):233-42. doi: 10.1016/s0168-1656(02)00107-4. PMID: 12084479.
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