[A+] 서강대 현대생물학실험1 Taq DNA polymerase의 활성

소개글

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목차

현대생물학실험1 Report
Introduction
Materials and Methods
Result
Discussion
Reference

본문내용

❚ 실험 초록 Taq DNA polymerase를 얻기 위해, pTTQ18 vector에 Taq DNA polymerase gene을 삽입하여 E.coli에 도입시켰으며, ampicillin이 첨가된 LB에서 pTTQ18 vector가 도입된 E.coli를 선별하여 target gene을 발현시켰다. 발현된 E.coli를 Lysozyme과 Nonidet P40, Tween 20을 이용하여 cell disruption했으며, target 단백질을 정제하는 방법으로, 75℃에서 1시간 incubation하여 변성된 단백질을 제거하였고, 뒤이어 (NH4)2SO4를 이용한 salting out method와 protein dialysis를 이용하여 Taq DNA polymerase를 정제하였다. 정제된 단백질의 활성을 알아보기 위해, 752bp의 template DNA를 정제된 단백질로 PCR한 뒤, agarose gel electrophoresis를 이용해 PCR된 결과를 확인하였다. 실험을 통해 정제된 Taq DNA polymerase가 활성을 나타냄을 확인하였다. 그러나, 1X Taq DNA polymerase를 사용했을 때, 적은 세기의 target DNA band와 아래쪽으로 smear 현상이 관찰되었으며, 이는 PCR에서 높은 농도의 Taq DNA polymerase가 이용될 경우, 잉여 Taq DNA polymerase가 5’ to 3’ exonuclease로 작용하여 template DNA를 DNA fragment로 분해하였기 때문으로 보인다. 한편, 단백질 정제를 통해 얻은 product에 존재하는 DNA나 다른 불순물에 의한 오염을 줄이기 위해 anion exchange chromatography를 시도해볼 수 있을 것이며, 간접적인 방법 대신 정제된 Taq DNA polymerase를 SDS-PAGE 방법으로 직접 분리하여 확인해볼 수도 있을 것이다.

참고 자료

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