[생명공학 레포트] gDNA isolation 및 T7E1 assay를 통한 genome editing 확인

소개글

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목차

1. gDNA isolation
2. PCR(Polymerase Chain Reaction)
3. T7E1 assay
4. Next Generation Sequencing 논문 요약
5. 참고문헌

본문내용

gDNA isolation
gDNA는 plasmids와 같은 extra-chromosomal DNAs와는 다르게 chromosomal DNA를 의미한다. 이 gDNA를 분리하는 단계는 첫번째로 cell과 CLS(Cell Lysis Solution) 300마이크로리터 그리고 proteinase K 15마이크로리터를 섞어준다. 여기서 CLS의 역할은 DNA의 추출을 위해 cell을 파괴하는 역할을 하는 용액이다. CLS에는 SDS(sodium dodecyl sulfate), Tris-HCl, EDTA 등이 들어가 있으며, SDS는 cell membrane에 있는 lipid를 제거하는역할, Tris-HCl은 pH변화를 방지해주는 buffer역할을 하고, EDTA의 경우 세포내의 DNases의 역할을 억제한다. 마지막으로 proteinase K는 DNA를 분해할 수 있는 nucleases와 같은 단백질을 분해시켜주는 역할을 한다. 이후 incubation을 통해서 위의 물질들이 작용을 잘 할 수 있도록 해준다. 이후 PPS(protein precipitation solution) 을 100마이크로 넣어주고 vortexing 시켜 세포가 깨지면서 나오는 단백질들을 잘 분리시키고precipitation 시켜준다. 이후 용액을 원심 분리시키고 위쪽의 용액들만 새로운 tube로 옮긴다. 이후 isopropanol을 넣어주는데 이 isopropanol의 역할은 원심분리 시 pellet형태로 DNA를 침전시키는 것이다. 원심분리 후 supernatant는 버려주고 pellet을 70% 에탄올로 washing해준다. Washing 과정을 통해 염과 같은 물질들을 씻어내고 더 순수한 DNA를 얻어낸다. 그다음 마지막으로 원심분리 시켜주고 증류수에 희석시키는 resuspension과정으로 안정화시키고 보관하도록 한다.
PCR(Polymerase Chain Reaction)
PCR을 간단하게 설명하면 실험자가 관심이 있는 DNA sequence 조각을 수백만배로 증폭시키는 기술이다.

참고 자료

없음