Gene silencing - Western blot & CTCF knockdown

소개글

Western blot을 이용하여 shRNA를 통해 CTCF를 knockdown 시킨 결과를 확인한다.

목차

Ⅰ. Introduction 실험 원리
Ⅱ. Material & Method 실험 재료 & 방법
Ⅲ. Result 실험 결과
Ⅳ. Discussion 고찰
Ⅴ. Reference 참고문헌

본문내용

Ⅰ. Introduction
1. 실험원리
1) Western blot
특정 단백질의 유무 또는 양을 알기 위해 수행하는 분석방법이다. 주로 단백질의 발현 여부를 알기 위해 사용한다. 서던 블랏(southern blot)과 노던 블랏(northern blot)이 DNA-DNA, DNA-RNA간의 특이성을 이용하는 데 반해 웨스턴 블랏은 단백질-단백질간의 특이성을 이용한다. 주로 항원-항체(Antigen-Antibody)반응을 이용한다. 항원-항체(Antigen-Antibody)반응을 이용하기 때문에 매우 높은 특이성을 지닌다. 먼저 젤을 만드는데, 젤은 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤에 SDS를 넣은 것을 사용한다. Polyacrylamide, SDS, Ammonium persulfate, TEMED를 틀에 넣어 굳혀서 젤을 만든다. 굳히는데 30분정도 기다린다. 장치에 loading buffer를 채운다. 단백질은 5분간 90도에서 denaturation시킨다. 단백질을 loading 하기 전 well을 씻어준다. 단백질을 loading한다. 혼합단백질을 SDS-PAGE에 전기영동한다. 전기영동이 끝난 후 젤을 Transfer buffer에 넣는다. Transfer는 단백질을 나일론 막으로 옮기는 작업이다. Transfer membrane을 젤 크기에 맞추어 자른다. 나일론 membrane을 순수한 메탄올에 적신다. 몇 분 후 paper2장, membrane, gel, paper2장의 순서로 겹쳐 놓는다. (단백질이 아래쪽으로 이동할 것을 가정하였을 때) 판 위에 Transfer buffer를 적신다. 100V에서 90분간 transfer한다. Transfer한 후, blocking을 진행한다. TBS로 membrane을 15분간 2회 washing 후 1% BSA-TBST에 1~2시간 혹은 5% non-fat dry milk에 30분간 담가둔다.

참고 자료

강영희, 생명과학대사전, 2008년, 아카데미서적
세화편집부, 화학대사전, 2008년, 세화
한국유전학회, 유전학실험서, 2004년, 라이프사이언스
박인원 역, 생화학, 2016년, 범문에듀케이션
이병룡 외 12명, 생화학, 2014년, 교보문고
Wikipedia: ‘Northern Blot’, ‘Southern Blot’, ‘Housekeeping Gene’