[유전공학실험] A+레포트 / 단백질 추출과 BCA assay (Protein preparation and BCA assay) 실험레포트

소개글

"[유전공학실험] A+레포트 / 단백질 추출과 BCA assay (Protein preparation and BCA assay) 실험레포트"에 대한 내용입니다.

목차

1. 실험 목적

2. 실험 이론
1) 단백질 추출
2) 단백질 정량
3) spectrophotometer

3. 준비물
1) 실험 기기
2) 재료 및 시약

4. 실험 방법
1) Protein preparation
2) BCA assay
3) Spectrophotometer 사용

5. 실험 결과

6. 논의 및 고찰
1) 두 가지 protein sample 희석용액의 흡광도가 차이가 나는 이유는 무엇인가?
2) 본 실험에서 사용한 SDS는 어떤 역할을 하는가?
3) BCA assay에서 BSA를 standard protein으로 사용하는 이유는 무엇인가?
4) 단백질을 분리할 때, 생체 외 분리가 아닌 생체 내 분리방법에는 어떠한 것이 있는가?

본문내용

1) 실험 목적
transfection한 세포에서 단백질을 추출하여 BCA assay를 시용하여 흡광도를 확인한다.

2) 실험 이론
(1) 단백질 추출
단백질을 분석하기 위해서는 가장 먼저 단백질을 추출해야 한다. 세포에 유전자를 도입시켜 단백질을 생산할 수도 있지만, 생체 외에서도 전사와 번역과정을 거쳐서 단백질을 생산 및 추출할 수 있다. 클로닝된 유전자를 발현벡터에 도입하고 바이러스 RNA 중합효소를 넣어주어 mRNA를 생산하고, 만들어진 mRNA를 무세포 번역 시스템(cell free translation system)을 이용하여 단백질을 생산한다. 발현벡터를 제조할 때는 전사 개시점과 종결점, 번역 시작 코돈과 번역 종결 코돈이 완전한지 확인해야한다. 벡터의 전사 종결점 이후의 제한효소 자리를 이용하여 플라스미드를 선형으로 만들어주고, 바이러스 RNA 중합효소와 rNTP 등을 넣어주어 RNA를 합성한다. 합성된 RNA를 무세포 번역 시스템에 넣어 반응을 진행시킬 때 반응액에는 리보솜, tRNA 및 단백질 합성에 필요한 모든 물질들이 포함되어있다. 또한 한 가지 아미노산이 표지되어있어 합성되는 단백질이 방사성을 나타내도록 하면 단백질 추출이후 확인과정(SDS-PAGE 등)에서 용이하게 사용할 수 있다. 이 방법으로 많은 단백질을 얻을 수는 없지만 유전자 산물을 빠르게 얻을 수 있기 때문에 돌연변이 확인이나 단백질 접힘 및 변형의 연구에 많이 쓰인다. 단백질이 독성이 있어 세포 내에서 발현이 어렵거나 불용성인 봉입제로 생산되거나 세포 내에서 분해효소에 의해 빠르게 분해되는 경우에도 이 방법이 활용된다.

(2) 단백질 정량
단백질 정량은 시료 내에 포함된 단백질의 양 혹은 농도를 구하는 과정으로, 대부분의 실험에서 실험의 준비단계에 시행된다. 따라서 단백질 정량이 잘못될 경우 실험 전체의 결과에 오류가 생길 수 있기 때문에 정확하게 정량하는 것은 매우 중요하다. 정확성뿐만 아니라 간편성도 중요하게 여겨지기 때문에 다양한 방법들이 개발되어왔다.

참고 자료

없음