재조합 단백질의 발현, 정제 및 정량

목차

1.Abstract
2.Introduction
3.Method & Material
4.Result
5.Discussion

본문내용

이번 실험에서는 대장균에 6x Histidine으로 tagging 된 eGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)를 발현시킨 후 이것을 정제하고 확인하는 실험이다. 먼저 목적 단백질(target protein)을 암호화하는 유전자를 대장균에 삽입하고 항생제인 kanamycin을 포함하는 LB에 대장균을 배양한 다음 이것을 sonication을 사용하여 세포 안의 구조체 등을 파괴한 다음 원하는 단백질을 분리하였다. Ligand와 binding하는 금속 이온인 Ni이온이 Histidine의 Imidazole ring의 질소(Nitrogen)와 결합하는 방식을 이용한 IMAC(Immobilized metal affinity chromatography)을 이용하여 Histidine으로만 표시된 eGFP를 분리하고 Imidazole이 포함된 elution buffer을 이용해서 경쟁적으로 resin에 붙게 하여 Histidine으로 표시된 eGFP를 정제하였다. 그 다음 단백질과 Cu 복합체에 의한 Folin-Ciocalteu reaction의 환원반응으로 색의 변화가 일어나는 것을 이용해서 단백질 정량 방법중의 하나인 Lowry assay를 통해 정량을 확인했다. 그리고 얻은 단백질이 eGFP가 맞는지 확인하기 위해 Spectrofluorometer를 이용하여 단백질의 Excitation과 Emission의 파장의 길이를 측정해 보았다. 실험 결과 Excitation wavelength는 492~495nm 파장에서 최대값을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, Emission wavelength는 505~510nm 파장에서 최대값을 가지는 것을 확인할 수 있었다. eGFP의 excitation 최대 파장은 490nm이고, emission 최대 파장은 510nm이므로 이 단백질은 eGFP라고 유추할 수 있었다.

참고 자료

Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky, Jackson, 2012, Campbell Biology Ninth Edition, PEARSON,
최철희, 창의와 소통, 세포생물학, 2013, 1st ed., pp.76-78
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