아주대학교 생화학실험, RNA추출과 단백질 정량, SDS-PAGE와 Western Blotting

소개글

아주대학교 생화학실험 RNA 추출, 단백질 정량 후 SDS-PAGE에 의한 전기영동과 Western Blotting까지
연계한 보고서 입니다.

목차

1. 실험제목

2. 실험목적

3. 결과
1) RNA isolation& PCR
2) 시료준비와 단백질 정량
3) 단백질 전기영동과 Gel staining
4) Western blot

4. 참고문헌

본문내용

<실험제목>
RNA isolation& PCR, 시료준비와 단백질정량 그리고 단백질전기영동과 면역발색법
<실험목적>
phenol-chloroform extraction 방법을 이용하여 RNA를 추출하고, PCR을 사용하여 전사단계에서 α-syntrophin 단백질의 발현이 어떻게 되는지 관찰한다. 또한, 세포를 파쇄하는 법을 익혀 SDS-PAGE를 위한 시료를 준비하고 Bradford method를 이용하여 준비된 consh와 α-synKD 단백질을 정량해보고 정량의 원리를 이해한다. 마지막으로 SDS-PAGE와 western blotting의 원리를 이해하고 이 방법들을 이용하여 단백질을 검출해본다.
<결과
Ⅰ. RNA isolation& PCR
1.결과 사진
아래의 표를 참고하여 4개의 튜브를 만들어서 전기영동 하였다.

<중 략>

하는 단백질의 크기에 따라 6~15%를 주로 사용하고 pH는 8.8정도로 맞춰주어 분리한다. stacking gel은 아크릴아마이드와 비스아크릴아마이드의 그물구조가 크기 때문에 단백질의 크기와 속도에 대한 차이가 없다. 따라서 단백질들을 응축시켜 시작점을 같게 해주는 역할을 한다. buffer 안의 glycin의 P.I 값이 6.1 정도 이기 때문에 stacking gel에서는 Cl>단백질>glycin순서대로 따라 내려가기 때문에 glycin이 단백질을 눌러줄 수 있다. 하지만 running buffer로 넘어오게 되면 Cl과 glycin은 단백질보다 먼저 빠져 내려와 버리기 때문에 단백질이 분리되면서 내려올 수 있게 된다. gel을 만들때는 밑 부분인 running gel을 먼저 만들고 굳으면 stacking gel을 만든다. 맨 윗부분에는 isopropanol을 잠시 동안 코팅해주어 공기와 맞닿지 않고 편평하게 만들어 준 후 씻어내고 comb를 꽂아 well을 만들면 된다. SDS-PAGE를 진행하고 gel staining을 통해서 gel을 염색하여 밴드의 위치를 확인하였으나 처음부터 너무 많은 양을 로딩하는 바람에 색이 진해서 구분하기 힘들었다. 그래프 상으로는 이동한 거리가 멀어질수록 단백질의 분자 크기는 점점 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

참고 자료

강호일 역, 단백질 실험 핸드북, 2007
박상대 등 저, 분자세포생물학, 1998
생명과학 8판, 2008, Campbell 외 6명
Tamm, Lukas K, Protein interactions, Johnwiley&Sonslnc, 2007
김승호 역, 단백질 실험노트, 2001