Western blotting in cell signaling

소개글

세포 내에는 많은 molecule들이 세포의 기능을 위해 각자의 역할을 한다. 그리고 이러한 molecule들은 대부분이 protein형태를 띠고 있다. 이 protein들 또한 모두 세포내의 DNA로부터 시작되는 central dogma를 따른다. (DNA → RNA → Protein) 많은 실험실에서 광범위하게 사용되는 RT-PCR의 경우 외부의 자극에 따른 세포내의 새로운 혹은 일정량이 발현되고 있는 molecule의 변화를 mRNA수준에서 확인하는 실험이다. 물론 이 실험방법 또한 mRNA의 변화량이 직접적으로 protein의 변화에 영향을 주기 때문에 의미를 지니지만 특정 molecule의 경우 증폭된 mRNA의 발현양이 실제로 protein의 양에 큰 영향을 주지 않는 것으로 밝혀지기도 한다. 그리고 또한 많은 protein의 경우 생성되는 것과 그 molecule이 기능을 수행하는 것은 다른 의미를 지니기 때문에 가장 직접적인 확인방법은 protein level에서의 확인이고 western blotting이 바로 그 실험 방법이다.

목차

1. 실험목적 및 원리
2. 실험 과정
● Sample preparation
● preparation of the three protein samples for loadingon the SDS gel
● preparation of SDS gel (SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
● loading on the SDS gel and protein electrophoresis
● Wet transfer
● Immunoblotting
● ECL
3. 실험 결과
4. 실험 결과 분석 및 고찰

본문내용

1. 실험목적 및 원리

세포 내에는 많은 molecule들이 세포의 기능을 위해 각자의 역할을 한다. 그리고 이러한 molecule들은 대부분이 protein형태를 띠고 있다. 이 protein들 또한 모두 세포내의 DNA로부터 시작되는 central dogma를 따른다. (DNA → RNA → Protein) 많은 실험실에서 광범위하게 사용되는 RT-PCR의 경우 외부의 자극에 따른 세포내의 새로운 혹은 일정량이 발현되고 있는 molecule의 변화를 mRNA수준에서 확인하는 실험이다. 물론 이 실험방법 또한 mRNA의 변화량이 직접적으로 protein의 변화에 영향을 주기 때문에 의미를 지니지만 특정 molecule의 경우 증폭된 mRNA의 발현양이 실제로 protein의 양에 큰 영향을 주지 않는 것으로 밝혀지기도 한다. 그리고 또한 많은 protein의 경우 생성되는 것과 그 molecule이 기능을 수행하는 것은 다른 의미를 지니기 때문에 가장 직접적인 확인방법은 protein level에서의 확인이고 western blotting이 바로 그 실험 방법이다.

2. 실험 과정

 Sample preparation
① Lysis를 하고자 하는 cell이 배양된 dish를 준비
② 배지를 제거한 dish를 PBS를 이용하여 washing 후 suction을 이용하여 PBS를 제거 (이 과정은 lysis를 하기 전에 animal cell 주변의 배지를 완전히 제거한다.)
③ ice상에서 RIPA buffer 세포안에 있는 단백질을 일차구조로 만들어 주기위해 세포를 lysis시켜서 끓여줘야 하는데 이때 detergent가 들어가 있는 lysis buffer가 RIPA buffer이다.

를 준비 (RIPA buffer는 사용하기 전에 protease inhibitor를 섞어서 사용하여야 하며 RIPA buffer의 사용량은 100φ dish에 200㎕정도이다.)
④ Dish에 RIPA buffer를 첨가한 후 Scraper를 이용하여 한곳에 모은 다음 tube에 옮겨서 30분 동안 ice에 방치
⑤ 17000rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리
⑥ pellet을 건드리지 않고 상층액을 새로운 tube로 옮기고 -80℃에 보관

참고 자료

- 유전단백체 기능제어 연구센터 (Functional Genoproteome Research Centre) 홈페이지 (http://www.genehunters.co.kr/main.php)
- M. T. Madigan and J. M. Martinko. Brock biology of microorganisms (11st ed.). Prentice Hall, Upper Saddle River
- Gene Cloning and DNA Analysis; An Introduction, 5th Edition, 2006 (T. A. Brown, Blakewell Science)