[A0] 서강대 현대생물학실험2 2차 풀레포트 - TA cloning과 insert의 수확 - pGEM-T vector cloning, mini-prep, double digestion, gel extraction technique

소개글

"[A0] 서강대 현대생물학실험2 2차 풀레포트 - TA cloning과 insert의 수확 - pGEM-T vector cloning, mini-prep, double digestion, gel extraction technique"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Materials and Methods
4. Result
5. Discussion
6. Reference

본문내용

Gene X와 pGEM-T vector을 ligation하여 competent cell에 형질전환시켰을 때, blue colony는 21개, white colony는 2개 얻어졌다. 이러한 결과로부터 생각해볼 거리는 다음과 같다. 먼저 들어간 DNA의 양에 비해 생성된 colony의 수 자체가 작다. 즉, 형질전환효율이 매우 낮았다. 이전 실험에서 50 pg의 pUC19 vector를 형질전환시켰을 때, 20개의 colony가 형성되었으며, 형질전환효율은 2×106 CFU/ug이었다. 이번 실험에서 Vector는 50 ng, insert는 39.76 ng이 들어갔으며, 이를 통해 구한 CFU/μg은 23/(89.76 ng)×10^3 ng/ug×(1020 ul)/(120 ul) = 2,178 CFU/μg이다. 직접적으로 비교하기는 어렵지만, pUC19 vector의 형질전환에 비해 효율이 103배가량 감소했다. Insert만 형질전환 된 경우나 ligation되지 않은 T vector가 형질전환 된 경우 colony가 형성될 수 없고,[3], T4 DNA ligase의 활성정도 역시 낮은 형질전환효율에 영향을 줄 수 있다. 형질전환효율을 높이기 위한 방법으로 PEG를 첨가했을 때 ligation 효율이 증가한다고 알려져 있으며[4], ligase의 양을 늘려보거나 buffer의 조성, protocol 처리 시간 등을 변화시켜가며 최적 ligation 조건을 찾아볼 수 있다. 둘째로는, T Vector의 self-ligation 비율이 매우 높았다. Vector가 삽입되어 AmpR을 가지는 colony 중 white colony의 비율은 2/23 ≈ 9%에 불과하였다. 이는 vector가 ligation 되었을 때, insert가 삽입된 비율이 약 9%임을 의미하며, 나머지 81%는 self-ligation되었다고 볼 수 있다.

참고 자료

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Mahipal Singh et al.(2010), Plasmid DNA Transformation in Escherichia Coli: Effect of Heat Shock Temperature, Duration, and Cold Incubation of CaCl2 Treated Cells, IJBB, Vol. 6, No. 4, pp. 561-568.
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“10bp DNA Step Ladder.” Promega. Last modified N.D., accessed Nov 8, 2021, https://www.promega.kr/products/cloning-and-dna-markers/dna-ladder-rna-ladder/50bp-dna-step-ladder/?catNum=G4521