단백질 정량(Bradford assay)과 AP(Alkaline phosphatase)의 specific activity 측정

소개글

Brandford assay의 원리, 방법등이 자세히 나와있으며
specific activity를 구하는 자세한 풀이과정도 있습니다.
A+이었습니다^^

목차

1. subject
2. object
3. introduction
4. materials
5. method
6. result
7. discussion
8. reference

본문내용

⑴ 8개의 microtube 각각에 0, 1, 2, 3, 4, 5, b(before), a(after)라고 labeling 한다.
⑵ 8개의 microtube 각각에 D.W 800㎕씩 pipet으로 넣고(p1000-080), 표에 주어진 D.W의 양을 맞추기 위해 0은 그대로 1은 1㎕씩, 2는 2㎕씩, 3은 3㎕씩, 4는 4㎕씩, 5는 5㎕씩, b와 a는 2㎕씩 가장 얇은 pipet으로 빼준다.(0은 BSA(enzyme)가 아무것도 들어가지 않는 것으로 blank의 역할을 한다. 즉, blank는 따로 만들지 않아도 된다.)
⑶ 0에는 BSA를 넣지 않으며, 1에는 1㎕, 2에는 2㎕, 3에는 3㎕, 4에는 4㎕, 5에는 5㎕를 넣고 b에는 before sample 2㎕를, a에는 after sample 2㎕를 넣어준다.
⑷ 8개의 microtube 각각에 Bradford를 200㎕씩 넣어준다.(p200-200)
- bradford는 넣자마자 단백질(BSA)과 반응하여 색깔을 낸다. 흰종이에 대고 0, 1, 2, 3, 4, 5의 색깔을 비교해보면 단백질(BSA)의 농도가 짙을수록 bradford와 반응하여 짙은 색을 냄을 알 수 있다.
- 각각의 microtube에 bradford를 넣는 것은 timer를 이용하여 처음 것에 넣고 30초 후에 그 다음 것을 넣은 후에 그 전것을 voltexing하는 방식으로 한다.
(결국 각각의 microtube에는 1000㎕ 즉 1ml이 들어있는 것이다.)
⑸ microphotometer를 사용하여 standard를 curve를 구한다
- 차례대로 0, 1, 2, 3, 4, 5, b, a를 큐벳 안에 넣은 후(구멍이 투명한 곳에 오도록) standard measure, enter를 차례대로 누른다.(결과 값과 그에 따른 그래프가 출력)
-> standard curve를 알고 있으므로 흡광도를 알고있으면 BSA 단백질정량을 구할 수 있다.
-> before와 after의 absorbance값을 가지고 specific activity를 구할 수 있다.

참고 자료

강정아인(2006), 단백질 실험노트, 월드사이언스
David T. plummev(1993), An introduction to practical biochemistry(2nd Ed.)
대학화학실험법 편찬위원회, (공학용)대학화학실험법, 단국대학교 출판부, 2005
한국 생화학회, 『실험생화학 개정 3판』, 탐구당, 1999