[유전공학실험] A+레포트 / 단백질 발현 확인 (Dot blot and SDS-PAGE) 실험레포트

소개글

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목차

1. 실험 목적

2. 실험 이론
1) Dot blot
2) SDS-PAGE

3. 준비물
1) 실험 기기
2) 재료 및 시약

4. 실험 방법
1) Dot Blot
2) SDS-PAGE gel 만들기
3) Gel electrophoresis

5. 실험 결과
1) Dot blot
2) SDS-PAGE

6. 논의 및 고찰
1) Dot blot에서 우유가 아닌 탈지유(skim milk)를 사용하는 이유는 무엇인가?
2) SDS-PAGE에서 두 가지의 gel(stacking gel과 separating gel)을 사용하는 이유는 무엇인가?
3) 단백질을 확인하는 방법에는 SDS-PAGE 외에 어떠한 방법이 있는가?

본문내용

(1) Dot blot
사진10-1. Dot blot의 원리
Dot blot은 단백질 검출을 위해 면역학적 기술인 항체에 의한 항원의 인식 및 결합에 의존하는 원리를 이용하는 방법이다. SDS-PAGE를 통해 단백질을 분리하고 전기영동 시키는 과정 없이 세포 용해물을
nitrocellulose membrane 혹은 PVDF(polyvinylidene fluoride) membrane에 spotting하고 용기에 넣어 blotting을 수행한다. blotting 과정에는 차단 buffer, 단백질 결합 항체, 기질, wash buffer가 사용된다. 차단 buffer는 비특이적 결합을 차단시켜 Dot blot의 특수성을 높여준다. 차단 buffer를 이용하지 않는다면, 항체는 전하에 의해 비특이적인 단백질에 결합될 수 있다. 따라서 차단 buffer를 통해 단백질이
항체를 끌어당길 수 있는 전하를 차단한다. 주로 탈지분유, bovine serum albumin, casein 등을 차단
buffer로 사용한다. 현재에는 합성 혹은 비절연 단백질의 다양한 차단 buffer가 만들어져 판매되고 있다. 2차 항체에는 방사선 필름으로 감지되는 빛이나 membrane에 시각화된 색을 생성하기 위해 기질을 촉매하는 효소가 결합되어 있는데, 이 효소로는 주로 서양 고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)나
염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase, AP)를 사용한다. Dot blot은 크로마토그래피나 전기영동보다 훨씬 빠르게 수행되고, 비용이 적게 든다는 장점이 있다. 또한
복잡한 blotting 절차가 필요하지 않다. 하지만 western blot을 더 간편화한 것이기 때문에 정량성은 떨어지고, target 단백질의 크기에 대한 정보는 얻을 수 없다. 크기별로 분리되어 있지 않기 때문에 비특이적
결합 등을 감지하기 어렵다. - western blot과의 차이점
western blot은 폴리아크릴아마이드 젤, 분자량 ladder, loading dye, 젤을 실행할 장치, 완충액 등의 재료가 더 필요하다. 또한, 젤을 만들고 sample을 젤에서 membrane으로 옮기는 추가 과정이 진행되어야
하므로 더 많은 시간이 걸린다.

참고 자료

없음