Plasmid preparation / Restriction enzyme digestion / Plasmid insert orientation check

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목차

1. Plasmid prep.
2. Restriction enzyme digestion
3. Plasmid insert orientation check
4. Vector map 그리기

본문내용

Introduction(실험소개)
플라스미드를 추출하여 목적한 recombinant plasmid가 제대로 구축되어 DH 5α세포에 들어갔는지 확인하는 작업을 가지기에 앞서, 우선적으로 플라스미드를 뽑는 plasmid preparation 과정을 가진다. 메뉴얼과 키트를 이용하는 방법 중, 키트를 이용해 균을 추출하는 방법을 실험할 것이다.

material method
실험 재료로는 컨트롤(블루 콜로니), 화이트 콜로니 2개의 샘플, sol I, sol II, sol III, 스핀칼럼, 워싱 버퍼, 에펜도르프 튜브, 3차 증류수 등이 필요하다.
우선 sol I을 200μl 이용해 균을 resuspention 시킨 다음 sol II 350μl로 cell을 lysis 시킨다. sol II를 넣어준 후, inverting으로 가볍게 lysis 시켜준다. 그러면 sol I을 넣었을 때 보다 clear하고 끈적해진 것을 확인할 수 있다. 다음으로 sol III를 넣고 중화시키는 단계를 가진다. sol III는 acetic acid 등으로 시큼한 냄새가 나며, Rnase A, 즉 효소가 들어있으므로 아이스에 넣어서 냉장 보관한 상태로 이용한다. 그 후 가볍게 inverting 해주면 각종 단백질 등으로 뿌옇게 침전물이 생긴 것을 확인할 수 있다. 그리고 balance를 넣고 13000rpm에서 5분간 centrifuge 실시한다. (여기서 sol I II III 볼륨은 키트의 프로토콜에 따라 조절한다.)
샘플이 Blue colony 1개, White colony 2개로 총 3개이므로 스핀칼럼을 3개 준비해준다. 스핀칼럼은 Gel extraction 했을 때와 동일한 것으로, 실리카 멤브레인이 붙어있는 튜브를 넣어 준비해준다. 스핀을 한 다음 실리카 멤브레인에 붙어있는 플라스미드를 일루션 해야하므로 에펜도르프 튜브도 3개 준비하고 라벨링 해준다.

참고 자료

없음