[분자생물학실험]Scalp와 Skin에서의 미생물 DNA 추출 그리고 NGS를 통한 미생물 분석

곰뚱

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최초 등록일: 2021.03.03
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소개글

"[분자생물학실험]Scalp와 Skin에서의 미생물 DNA 추출 그리고 NGS를 통한 미생물 분석"에 대한 내용입니다.

본문내용

1. 실험 이론 및 원리
1.1. 실험 요약
본 실험에서 두피와 귀 뒤쪽의 피부를 swab으로 긁고 tube에 넣어, 막을 파괴하고 온전한 DNA를 얻기 위해 ST buffer와 Proteinase K 처리를 하였다. Buffer와 column을 이용해 불순물을 제거해 깨끗한 DNA를 얻었다. DNA의 농도를 260㎚에서 측정한 결과, Scalp는 1.01ng/㎕, Skin은 2.599ng/㎕가 나왔다. 이후 각각의 DNA sample에 대해 Amplicon PCR을 했다. PCR primer의 locus-specific 서열이 16S rRNA의 V3와 V4영역에 상보적이므로 template DNA에 결합하고 overhang adapter 서열은 두번째 PCR인 index PCR의 primer와 붙어 fusion이 가능하다. Amplicon PCR 산물은 기존의 V3-V4 region의 크기가 464bp이고 프라이머가 붙어 550bp정도가 된다. Index PCR을 진행 시, 결과적으로 V3-V4 region을 포함하며 양쪽에 flow cell과 결합하는 서열과 indexing 서열이 존재하고, 630bp정도의 크기를 갖는다. XP bead를 이용해 clean up을 해준 후에 DNA와 결합하는 PicoGreen시약을 이용해 농도를 측정해 이후에 실험을 위해 4㎚로 맞추었다. 이후에 0.2N NaOH를 이용해 라이브러리를 변성하여, PhiX를 넣어 다양성이 적은 라이브러리에 다양성을 확보한다. Hybridization buffer로 희석하여 에러를 줄이고, 카트리지에 샘플을 Loading하였다. Flow cell도 Illumina사의 MiSeq 기계에 넣으면 라이브러리가 flow cell에 상보적으로 결합하여 sequencing 반응이 진행된다. 얻은 데이터는 조작 분류단위 방법을 이용해 존재하는 미생물의 종류를 알아낸다. 실험결과 Skin과 Scalp 모두 Bacteria가 Kingdom에서 98%이상을 차지했다. Skin에는 Phylum에서 Firmicutes가 가장 많았는데 이들은 지방과 관련된 기능을 하는 것으로 알려져있다. Scalp에는 Actinobacteria에 속하는 Actinomycetales(order)가 굉장히 많았다.

참고 자료

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