포항공대 화학생명공학실험[포스텍 A]Pre-Report (Mini-prep for TA Cloning & DNA Sequencing)

소개글

포항공대 화학공학과 전공필수 과목인
화학생명공학실험 보고서입니다
PRE-Report 는 실험전 사전지식을 정리하는 보고서이고
Final-Report는 실험후 결과를 정리하는 보고서 입니다.

두가지를 모두 참고하셔서 과제에 도움이 되시길 바랍니다.

목차

1. 실험 제목
2. 실험 목적
3. 이론 및 배경지식
4. 시약 및 기기
5. 실험 순서
6. 주의사항

본문내용

1. 실험 제목
Mini-prep for TA Cloning & DNA Sequencing

2. 실험 목적
Insert vector와 genomic DNA의 특징을 이해하여 E.coli로부터 insert vector를 뽑아내고 DNA를 정제한다. 또한, DNA sequencing의 원리를 이해하여 sequencing 결과를 해석한다.

3. 이론 및 배경지식
1) DNA Mini-Prep
DNA preparation은 세포를 파괴하여 그 속에서 DNA를 추출해 정제하는 총 과정을 의미한다. DNA의 크기에 따라서 preparation은 mini, midi, maxi, mega, giga등으로 나눌 수 있고 본 실험에서는 mini-preparation을 진행하게 된다. Mini의 경우 50~100 μg 정도의 plasmid를 추출하는 방법이다. Preparation은 크게 두 단계로 이루어진다. 첫 번째는 세포를 lysis 하여 세포 내 구성물질을 용액화 하는 과정이다. 두 번째는 plasmid DNA만 분리해 내는 것이다. 세포막을 제거하기 위해서는 끓이거나 알칼리를 처리하는 방법이 있지만 lysis buffer를 사용하는 것이 일반적인 방법이다. Buffer에는 Lysozyme, EDTA, Sucrose solution, trition x-100이 포함되어있다.
Lysis가 완료되면 용액에는 bacteria cell의 genomic dna와 plasmid dna가 마구 섞여있게 된다. 실험자가 원하는 Plasmid DNA를 추출해 내는 방법은 크기에 기초한 방법이 있고, 입체구조에 기초한 방법이 있다. 일반적으로 크기에 따라 분리를 하게 되면 플라스미드가 큰 경우 세포 잔해와 함께 침전될 수도 있다. 따라서 입체구조에 기초한 방법을 사용하는 것이 좋다.

2) Alkaline denaturation
Alkaline denaturation은 입체구조에 기초한 분리방법 중 하나이다.

참고 자료

Sambrook et al, Molecular Cloning 3rd Ed. Vol.1, Chapter 1
A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase, Sanger Frederick, J. Mol. Biology, 1975, 94, P.441~446