SDS PAGE & sample 제조

목차

I. Principle
II. 도구
III. 실험방법
IV. 결과
V. 토의
VI. 참조

본문내용

I. Principle
 전해질 중에 존재하는 하전(荷電) 입자에 직류전압을 걸면 정의 하전 입자는 음극으로, 부의 하전 입자는 양극으로 향하여 이동한다. 이 현상을 전기영동이라고 한다. 또한 동일 방향으로 이동하는 하전 입자의 사이에서도, 전기영동할 때 이동속도가 다른 성분은 점차로 분리되어 간다.
 1970년, Laemmli, U.K에 의해 이를 활용한 SDS-PAGE가 개발되었으며, 오늘날 광범위하게 사용되고 있다. 이 방법의 장점은 많은 용적의 시료를 로딩해도 좋은 해상도를 얻을 수 있다는 것이다. Acrylamide를 가교제(cross-linker)로 중합한 polyacrylamide gel은 acrylamide와 가교제의 농도 및 비율에 의해 gel내 미세 통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체분자들을 분리할 수 있을 뿐만 아니라 높은 정밀도와 고 분해능으로 인해 오래 전부터 단백질, 핵산 등의 분리에 널리 사용되어 왔다.
 SDS는 ionic detergent 역할을 하여 protein을 negative charge로 둘러싼다. 이것은 protein 간의 전하 차이를 제거하고, folding 구조를 깨뜨려 모양의 차이도 없앤다. 그로인해 electrophoresis를 할 때 순수하게 size에 해당하는 속도로 migration 되게 해준다.
 running gel 과 stacking gel의 pH가 차이나는 이유
- Stacking gel과 running gel은 acrylamide의 함유량도 차이를 보이지만 pH의 차이가 두 gel이 다른 역할을 하게 하는 핵심 요소이다. Sample을 loading한 후 전기장을 걸어주면 단백질을 비롯한 여러 이온들이 gel을 이동하게 되는데 이 이온들에는 Cl-와 glycine 이온들이 함께 들어있다. 이 이온들은 electrophoresis buffer 내에 함유된 이온들로서 이 두 이온이 단백질의 이동에 큰 역할을 하게 된다.
- ① Stacking gel
Glycine 이온은 net charge가 0이 되는 pI 값이 6.2인데 stacking gel의 경우 pH 가 6.8이므로 이로 인해 Cl-와 glycine 간의 이동속도의 차이가 생기게 된다. Cl-, 단백질, glycine은 모두 (-)를 띄게 되는데 Cl-는 그 분자량이 아주 작기 때문에 가장 빨리 내려가게 되고 glycine은 일부만 (-)를 띄기 때문에 이동속도가 가장 느리게 된다. 따라서 이동속도는 Cl->단백질>glycine 순서가 되게 된다.

참고 자료

http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=296421&cid=558&categoryId=558
http://www.genehunters.co.kr/Training/03_1.htm
http://dasan.sejong.ac.kr/~yjlee/p-agarose%20gel.htm
대한 생화학․분자 생물학회(1999):단백질 전기영동과 Wextern blot,실험생화학,5th,도서출판 바위, 서울, pp.190~194