Mini scale preparation of plasmid DNA and verification

소개글

유전자 재조합에 가장 빈번하게 사용되는 E.coli의 plasmid DNA를 추출하는 기술로서 alkaline lysis를 이용하여 plasmid DNA를 추출하고, 이를 restriction enzyme으로 분석하여 검증하는 실험보고서

목차

1. abstract
2. introduction
3. material & method
4. result
5. discussion
6. reference

본문내용

Abstract
이번 실험은 유전자 재조합에 가장 빈번하게 사용되는 E.coli의 plasmid DNA를 추출하는 기술로서 alkaline lysis를 이용하여 plasmid DNA를 추출하고, 이를 restriction enzyme으로 분석하여 검증하는 것이었다. Alkaline lysis를 이용한 Mini-scale preparation of plasmid DNA는 먼저 E.coli세포를 깨트리고 alkaline 조건을 제공하여 DNA를 denature 시킨 후 다시 pH를 중화시켜 다른 물질은 침전시키고, 마지막으로 에탄올을 이용하여 plasmid DNA를 침전시켜 최종적으로 plasmid DNA를 얻는 것이다. Cell은 앞선 실험에서 insert를 ligation하여 transformation시킨 것을 LB medium에 접종하여 overnight incubation하여 사용했으며 좀 더 순도가 높은 DNA를 얻기 위하여 Phenol/Chloroform 용액을 이용하여 수용액에 남아있는 protein을 제거하였다. 또한 정확한 검증을 위하여 RNase만 처리한 것(un cut)과 RNase, BamHⅠ과 HindⅢ를 동시에 처리하여 Double cut 한 것을 electrophoresis하여 그 결과를 비교하였다. 실험결과 un cut은 covalently closed circular (supercoiled) plasmid로 추정되는 3kb정도의 band와 open circular (nicked) plasmid로 추정되는 5kb 이상의 band가 관찰되었다. 또한 오염된 chromosomal DNA로 추정되는 10kb 이상의 band 두 개도 희미하게 나타났다. double cut은 insert로 추정되는 약 1.2kb의 band 하나와 vector로 추정되는 3kb정도의 band 하나가 관찰되었다. DNA의 상태를 확인하는 un cut은 오염된 chromosomal DNA가 관찰된 것으로 보아 실험과정에서 실수가 있었음을 예상할 수 있으며, cloning의 상태를 나타내는 double cut band는 예상대로 나온 것으로 보아 비교적 성공적인 실험을 진행하였다고 볼 수 있다.

참고 자료

한국생화학회, 실험생화학, 탐구당, 1999, pp.196~198
Daniel Lim, microbiology, The McGrew Hill Companies, 2003, pp.279~281
Madigan, Brock biology of Microorganisms, Prentice Hall, 2005, pp.142~143