연세대학교 생화학실험(2) - PCR-mediated mutagenesis Ⅱ

소개글

PCR을 이용해 deletion 시킨 mutant를 T-vector에 ligation한 후, restriction enzyme으로 잘라 mutation과 ligation이 잘 되었는지 확인해본다.

목차

◆ 실험일자
◆ 제출자
◆ 목적
◆ 원리
◆ 시약 및 기자재
◆ 방법
◆ 결과
◆ 고찰

본문내용

◆ 목적 : PCR을 이용해 deletion 시킨 mutant를 T-vector에 ligation한 후, restriction enzyme으로 잘라 mutation과 ligation이 잘 되었는지 확인해본다.
◆ 원리
<PCR product>
PCR에서 사용한 Taq DNA polymerase를 비롯해서 DNA polymerase는 DNA를 5`에서 3` 방향으로 합성하므로 template가 끝나는 부분에서 합성이 끝나 blunt end인 PCR product가 형성될 것을 예상하지만 실제로 PCR product의 모습은 다른 blunt end DNA와는 다른 다음과 같은 특징이 있다.
(1) Primer의 5`쪽에는 phosphate가 없다.
DNA의 5`에는 phosphate가 있으나 PCR 반응 산물의 5` 끝은 우리가 넣어준 primer로 이 primer의 5` 끝은 phosphate가 없다. Primer를 만드는 in vitro DNA synthesizer로 DNA를 합성하는 과정은 생체 내에서와는 달리 3`쪽에서 5` 쪽으로 되는데, 이 과정에서 5`의 phosphate가 붙을 수 없기 때문이다.
(2) Taq polymerase는 합성이 끝난 후 3` 끝에 A를 하나 더 붙인다.
이것은 Taq DNA polymerase의 고유한 성질로, template가 없음에도 불구하고 A를 하나 더 붙이고 끝나는데 이렇게 template 없이 3` 쪽에 nucleotide를 달아 가는 효소를 terminal deoxynucleotidyl transferase라고 한다. 그러므로 DNA ligation을 하기 위해서 T로 끝나는 vector를 쓰는 것이고 그것이 바로 T-vector이다.
->PCR product:

< T-vector>
이번 실험에서 사용된 vector는 Amp resistant gene과 LacZ gene, LacZ gene 사이의 multi-cloning site, 그리고 이 multi-cloning site 사이에 T-region(양쪽에 5’-T로 cohesive end로 되어있는 부분)이 있는 T-vector이다. Taq polymerase가 3’ 끝에 A를 붙이는 성질을 이용해 PCR product를 cloning할 때에는 이런 T-vector를 사용한다.

참고 자료

- 생화학실험(2) 실험교본, 연세대 생화학과.
- http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/