구강상피로부터 유전자의 추출 (HKG 이용 PCR & 전기영동) 실험 보고서

소개글

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목차

1. Introduction

2. Materials and Apparaturs

3-1 Methods for PCR
3-2 Methods for Electrophoresis

4. Result

5. Discussion
5-1 Electrophoresis 결과 해석
5-2 PCR 단계별 시약
5-3 Electrophoresis 시약, 원리
5-4 GAPDH & HKG
5-5 PCR Cycle 중 Annealing 단계의 중요성
5-6 RT PCR
5-7 등온증폭(LAMP, Loop-Mediated Isothermal Amplification)란?

6. Reference

본문내용

1. Introduction
지난 실험에서 원하고자 하는 genomic DNA가 제대로 추출되었는지 확인하기 위해 GAPDH Primer를 이용한 PCR을 하였다. PCR이 정상적으로 이루어졌는지 확인하기 위하여 전기영동을 진행하고 각 세부단계를 조사해보았다.
PCR 단계는 다음과 같다. 한 cycle은 Denaturing, Annealing, Extending 단계가 반복된다.
Denaturation 단계는 95℃까지 온도를 올린후 2~5분동안 incubation시켜 dsDNA가 ssDNA로 분리되게 한다. 상보적인 염기간 수소결합을 끊어주는 단계이다.
Annealing 단계는 95℃도에서 rimer의 melting Temperature보다 대략 5도 정도 낮은 온도(주로 45℃에서 60℃ 사이)로 낮추고 짧은 시간(30초 ~1분)동안 지속한다.
해당 단계는 Primer의 염기서열에 따라 다르기에 실험적으로 적정온도를 찾아야한다.
Extension 단계는 본격적인 elongation이 일어나는 단계로 Thermus aquaticus균이 지닌 Pol의 활성이 가장 좋은 온도인 72℃로 다시 올리게 된다. 해당 pol은 72℃에서 10초 이내 1000bp 정도를 합성할 수 있다. DNA의 Denaturation을 위한 94℃에 노출시키면 활성은 없지만 반감기가 9분 이상으로 나타난다.(F C Lawyer, 1993)
Electrophoresis
백금으로 이루어진 극에서는 물의 전기분해가 일어난다. TAE buffer가 가득찬 용액 자체도 회로의 일부로서 (-)극은 물분자가 전자를 얻어 수소기체를, (+)극에서는 전자를 잃어 산소기체를 발생시킨다.

2. Materials and Apparaturs
PCR - PCR premix(dNTP, 10XBuffer, taq polymerase, , glycerol, dye) tube, gDNA, 3차 증류수(DW), Thermal Cycler, 10㎕ pipette & tip, 4℃ fridge, pcr tube rack

참고 자료

Sigmaaldrich – Polymerase Chain reaction, Technical guide to PCR Tech
Researchgate - TECHNIQUES IN MOLECULAR BIOLOGY, Horizental gel electrophoresis
Brown, T. A. (2018). Genomes 4. Garland science.
Lawyer, F. C., Stoffel, S., Saiki, R. K., Chang, S. Y., Landre, P. A., Abramson, R. D., & Gelfand, D. H. (1993). High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5'to 3'exonuclease activity. Genome research, 2(4), 275-287.
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