Homologous recombination(LiAc yeast transformation),PCR확인,표현형확인,Spontaneous mutation frequency

소개글

생명과학전공실험중 LiAc 방법으로 yeast transformation해서 이후 PCR로 확인하였고

이후 표현형확인 (Spontaneous mutation frequency)을 한 결과보고서 입니다.

논문 2편을 참고하여 학부수준으론 매우 좋은 레포트라고 평가받았습니다. 연구실에 소속되어 있을 당시 작성한 레포트라 내용이 좋습니다. (10/10점)

*Canavanine,Hydroxyurea를 사용하여 yeast의 표현형을 확인하였습니다.

목차

1. 실험목적

2. 실험 재료 및 방법
(1) LiAc Transformation
Transformation material
(2) Cell culture
(3) 10.min.prep
(4) 확인 PCR
⑵ Electrophoresis
② gel running
(5) spontaneous mutation frequency
① mutation colony 선택
② 균 수 측정
(6) Spotting

3. 결과
1)LiAc transformation
2)확인 PCR
3)Spontaneous mutation frequency
4)Spotting

4. 고찰
1)왜 일부는 Transformation이 되지 않았을까?
① meterial을 제대로 넣지 않았다?
2)왜 확인 SD(-His)배지에서 자란 transformation 결과물이 PCR 과정에서 제대로 band가 나타나지 않았을까?
② Elongation time의 문제?
③ Taq polymerase가 상온에 너무 오래 있었다? 혹은 다룰시의 문제?
④ Homologous recombination이 양쪽이 아닌 한쪽에서만 일어나 결과적으로 Gene insert가 일어났다?
⑤ 확인 PCR을 더 많은 colony에서 했더라면 된것을 확인할수 있었을것이다?
3)Spontaneous mutation frequency의 결과
②결과의 분석
4)Spotting의 결과

5. 참고문헌

본문내용

1. 실험목적
1) Homologous recombination을 통해 이전에 제작한 PCR product를 삽입하고 원하는 gene을 knock-out한다.
2) 확인 PCR을 통해 해당 gene이 제대로 knock-out 되었는지 알아본다.
3) spontaneous mutation frequency와 spotting을 통해 sgs1와 msh6 gene의 기능을 생 각해보고 해당 gene이 knock-out 되었때의 표현형을 관찰한다.

2. 실험 재료 및 방법

(1) LiAc Transformation
a. Transformation 할 Cell을 YPD 배지에 Single colony를 따서 OD 0.5~1 사이가 될 때까지 키운다.

<중 략>

2)+hydroxyurea media에서 sgs1△이 덜 살아남는 경향성
hydroxylurea는 ribonucleotide reductase(RNR)을 저해한다. 이 RNR은 NTP를 환원하여 dNTP를 만드는 enzyme이다. 따라서 이 dNTP synthesis passway를 망가트리게 된다. 하지만 sgs1 gene이 있을시엔 이를 보완할수 있다.(사진3) 하지만 sgs1 gene이 knock-out 될시엔 이러한 기능이 결여되서 control media와 비교시 sgs1△이 덜 살아남는 경향을 보이게 된다. 따라서 sgs1 gene이 이러한 passway에 관여했으리라 생각된다.
3)hydroxyurea와 관련있는 gene
Knock-out 시 sensitive하게 반응하는 gene을 볼때(그림3) rad50,51,52는 DS break시 repair에 관련있는 gene이고 mec1,2는 cell cycle시 arrest된 것을 구출하는 gene이다. rad6,18은 postreplication repair에 관련이 있다. 따라서 hydroxyurea는 이러한 repair와 관련있는 gene과 밀접한 연관을 가지고 작용한다.

참고 자료

Genomes 3 유전체 분자생물학 / 이동희 외 / 월드 사이언스 / 2008
왓슨 분자생물학 6판 / 저자 Watson 외 / 바이오 사이언스 / 2010
Brock의 미생물학 12판 / 저자 Micheal T. Madigan 외 / 바이오사이언스 / 2009
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/locus.fpl?locus=sgs1
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/locus.fpl?locus=msh6
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/locus.fpl?locus=can1
http://en.wikipedia.org/wiki/Canavanine
http://en.wikipedia.org/wiki/Hydroxycarbamide
http://labs.fhcrc.org/simon/NCI_page_032499/32065/32065.html
Ahmet Koc, Linda J. Wheeler, Christopher K. Mathews, and Gary F. Merrill THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY pp. 223230