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동물세포 배양 평가A+최고예요

동물세포 배양 및 의약품 제제의 생산목차동물세포를 배양하는 목적 세포배양 동물세포 배양의 생산물동물세포(animal cells)를 배양하는 목적1. 효소, 호르몬, 백신, 면역 조절인자, 항암제 등 여러 종류의 의료용 치료 단백질을 생산하는 것 2. 장기(organ)나 조직(tissue)을 만들어 내는 일이다.동물세포 배양동물세포 배양이란 체외(in vitro)에서 인공적으로 체내(in vivo)와 유사한 조건을 제공하여 세포를 대량 증식시키는 방법이다. 이때 동물세포는 현탁(suspension) 상태나 단층부착(monolayer attachment) 상태로 생장한다.동물세포 배양시 고려사항1) 대부분의 동물세포는 표면에 부착하여 생장한다. 2) 동물세포는 미생물보다 크고 복잡한 세포로서 생장속도가 미생물에 비하여 매우 느리기 때문에 생산성이 낮고 배양 도중 미생물에 의해 오염되기 쉽다. 3) 배양에 필요한 배지의 조성이 완전하게 알려져 있지 않고, 혈청(serum)과 같은 값비싼 성분을 요구한다. 4) 동물세포는 섬세한 플라스마 막(plasma membrane)으로 둘러 쌓여 있어서 전단력(shear force)에 약하므로 산소 공급을 목적으로 한 심한 교반을 피해야 한다.동물세포 배양 중에서 포유동물세포(mammalian cells) 배양이 주류를 이루고 있기 때문에 양자를 혼동해서 사용하는 경우가 있다. 그러나 동물세포 배양에는 포유동물세포 이외에 곤충세포나 물고기세포의 배양도 포함되어 있다. 곤충세포는 강력한 프로모터를 갖고 있는 배큘로 바이러스(baculovirus)에 의해 감염시켜 유용한 단백질을 생성한다. 포유동물세포 배양으로 단백질을 생산하는 경우 숙주세포로는 대개 유전자 조작된 중국 햄스터 난소세포(Chinese hamster ovary cells, CHO cells)가 이용된다.세포 배양을 위한 동물세포의 처리동물세포를 배양하기 위하여는 동물의 특정 장기 또는 조직에서 떼어 낸 조직들을 처리하여야 한다. 우선 무균상태에서 T-플라스크나 롤러 하며 부착의존성 세포(anchorage-dependent cell)이다. 1차 배양은 배지에 의해 크게 영향을 받는다. 처리의 두 번째 단계는 EDTA, 트립신, 콜라게나아제(collagenase) 등이 포함된 용액을 사용하여 1차 배양세포를 플라스크 표면에서 분리하여 배양하는 것이다. 이때 얻어지는 2차 배양세포(secondary cell line)는 현탁액상에서 자라도록 적응되어진 비부착의존성(anchorage independent) 세포가 될 수 있다.배양에 사용되는 동물세포의 형태비부착의존성 세포인 림프구(lymphocyte) 부착의존성 세포인 상피세포(epithelial) 섬유아세포(fibroblast)동물세포 배양에 사용되는 배지포유동물세포 배양을 위해 사용되는 배지는 미생물 배양용 배지보다 복잡하며 고가이다. 미생물 배지를 구성하는 탄소원과 에너지원, 질소원, 무기염류, 미량원소 외에도 비타민, 생장인자, 완충제(buffering agent) 등이 포함되어야 하며 특히 5～20%의 혈청이 추가되어야 한다.동물세포의 배양 조건포유동물세포는 그 크기가 10～30μm로서 생장속도는 배가시간(doubling time)으로 표시하여 10～50시간이며 전형적인 값은 20시간이다. 세포농도는 현탁배양시 0.1～1g/L(0.5×106cells/mL～5×106 cells/mL)에 도달한다. 포유동물세포 배양을 위한 최적 환경조건으로 온도와 pH는 각각 37℃와 7.3이다. pH를 7.3부근에 유지하기 위하여 5%의 CO2가 보강된 공기를 사용한다. 탄산염 완충용액이 pH를 7.3부근에 유지하는 데 사용된다. 반면 곤충세포 생장을 위한 최적 온도는 약 28℃이며 pH는 6.2부근이다. 물고기 세포 배양의 적정 온도는 동물세포보다 낮은 25～35℃ 이지만 넓은 범위의 온도에서 잘 견디며, pH 7～7.5에서 잘 자란다.동물세포 생장에 필요한 산소요구량은 식물세포의 20% 수준으로 적은 편이지만 동물세포는 섬세한 플라즈마 막을 갖고 있어서 전단응력(shear stres한다 할지라도 전단응력에 따라 목적 생산물의 생산속도가 달라진다. 따라서 전단응력을 감소시킨 돛-형태 교반기와 노-형태 교반기가 개발되어 10～30rpm의 교반속도를 사용하고 있다.동물세포의 배양에 사용되는 배양조건은 세포의 증식을 목적으로 하는 경우와 분화를 목적으로 하는 경우에 따라 각각 다르다. 세포 증식의 최적 조건은 세포 농도가 낮고, 칼슘 농도가 낮으며(100～600μM), 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자 및 혈소판 유래 성장인자가 존재할 때이다. 세포 분화의 최적 조건은 세포 증식이 정지된 상태이며 세포 농도가 높고(1×105cells/cm2), 칼슘 농도가 높으며(300～1500μM), 분화 유발인자, 신경 성장인자 등이 존재할 때이다. 동물세포의 생장곡선은 보통 3일 정도의 유도기(lag phase)를 가지며 미생물의 생장곡선에 비하여 보통 정지기가 짧고 글루타민 대사산물인 암모늄과 포도당 대사산물인 젖산의 축적으로 인하여 정지기 말기부터 살아 있는 세포의 농도가 급격히 감소한다.포유동물세포의 배양 도구실험실에서 사용되는 동물세포 배양 용기로는 T-플라스크(100mL～1L), 패들형태의 자석 교반기가 있는 스피너 플라스크(100mL～1L), 약 1～5rpm으로 회전하는 롤러 병(roller bottle)(50mL～5L) 등이 있다.동물세포 배양의 종류1.초대배양 1) 조직배양(tissue culture) 2) 분리 세포배양(explant-out growth culture) - 밀도균형 원심분리법 - 세포관류법 2.계대배양초대배양과 계대배양1. 초대배양 조직배양 : 조직편을 1～2mm2 정도로 작게 나눈 다음 조직 편을 그대로 배양하는 방법 분리 세포배양 : 조직편으로부터 필요로 하는 세포만을 분 리하여 배양하는 방법 2.계대배양 세포가 단층으로 자라고 멈추기 때문에 배양접시에서 세포를 떼어내어 새로운 배양접시에서 배양하는 방법으로 세포를 증식시킨다. 이와 같이 세포를 동물에서 떼어 내어 일차, 이차, 삼차 등등과 같이 계속 배양하는 방법동물세포 배양의 생산물바이러스 백신 단일항체(monoclonal antibodies) 면역조절 인자 호르몬 효소 조직 및 장기 배양바이러스 백신바이러스는 동물세포에서 번식시킨 후 동물세포가 용해되면 바이러스가 방출된다. 이러한 바이러스를 무력화(inactivate)시키거나 약화(attenuate)시킨 것을 백신(vaccine)이라 하는데 이것을 인간이나 가축 등에 주사하면 동물세포는 항체를 만들어 내어 질병에 대한 면역을 갖추게 된다.단일항체(monoclonal antibodies)단일항체(monoclonal antibodies, MAb)는 동물세포 배양으로 얻어지는 가장 중요한 생산물 중 하나이다. 단일항체를 생산하는 하이브리도마(hybridoma) 세포는 동물에 항원을 주사한 후 항체를 생산하는 림프구(lympocytes)를 분리하고 이 세포를 골수종세포(myeloma) 등 종양세포(cancer cells)와 융합(fusion)시켜 만든 잡종세포이다. 하이브리도마 세포는 불멸성이고 무한정 분열할 수 있으며, 항원에 대해 매우 특이적으로 반응하는 단일항체를 분비한다.미국 FDA 승인 단일 진단 항체 제품명 대상질환 제조회사 Herceptin 유방암, 전이성 Genentech Ituxan B세포 임프종 Genentech Renicade Crohn's disease Centocor Redpro 혈소판 응고억제 Centocor Panorex 대장암 Centocor Synagis 소아 virus 감염 MedImmune Zenapax 이식거부 억제 (심장) Roche면역조절 인자동물세포 배양으로 생산하는 면역조절 인자로는 인터페론(interferon), 림포카인(lymphokine)과 인터루킨(interleukin)이 있다. 인터페론은 바이러스나 암 유발물질에 노출될 때 동물세포가 분비하는 항암 당 단백질(glycoprotein)로서 면역조절 인자(immunobiological regulator)의 한 예이다. 인터페론α(INF-α)는 바이러스의 자극을 받은 백혈구(진인자(mitogen)나 항원의 자극을 받은 T-림프구(T-lymphocyte)에 의해 만들어 진다. 림포카인은 인체의 면역반응을 조절하는 호르몬성 단백질이며 인터루킨은 항암제이다.호르몬호르몬 중 20～30개의 아미노산으로 된 비교적 작은 것들은 화학적으로 합성할 수 있다. 그러나 50～200개의 아미노산으로 된 동물 호르몬은 당 사슬이 연결되어 있으며 호르몬을 합성하는 기관을 세포 배양하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 에리스로포이에틴(erythropoietin, EPO)은 적혈구 생산을 조절하는 광범위한 빈혈 치료제로서 인공신장 환자로부터 에이즈 환자에 이르기까지 유용하게 사용되는 물질이다. 이 물질은 당 첨가반응(glycosylation)이 필요하기 때문에 동물세포 배양으로 만들어 낸다. 그 외 동물세포 배양으로 생산되는 호르몬으로 여포자극 호르몬(follicle-stimulating hormone)과 융모성(chorionic) 호르몬이 있다.효소동물세포 배양으로 생산할 수 있는 효소는 무수히 많 다. 예를 들어, 유로키나아제(eurokinase), 콜라지나아제, 펩신, 트립신 등과 혈액을 응고시키는 인자 VII(factor VII), 인자 VIII, 인자 X 등이 있다. 티슈 플라즈미노겐 활성제(tissue plasminogen activator, TPA)는 상업화되어 대량생산되는 효소이다. TPA는 혈전을 용해시키는 작용을 한다. 우리 몸에 상처가 나면 불용성 단백질인 피브린(fibrin)이 생성되어 혈전을 만들어 혈액이 응고됨으로써 더 이상의 혈액이 유출되는 것이 방지된다. TPA는 이러한 혈액 응고의 역과정인 피브리노리시스(fibrinolysis)에 작용하여 피브린을 용해시킨다. 이 과정에서 TPA는 플라즈미노겐(plasminogen)을 활성화시켜 플라즈민(plasmin)으로 변형시키고 이 플라즈민이 피브린을 용해시키는 작용을 한다.조직 및 장기 배양성공사례 1)인간 각막을 시험관에서 배양 2)인공피부 배양 3)손가락 관절을 동물의 몸 속에서 배양 ow}

공학/기술| 2009.12.13| 24페이지| 1,000원| 조회(1,095)

생명공학, 계대배양, 조직 및 장기배양, 동물세포 배양, 초대배양

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