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Edman 분해법

Edman 분해법Edman 분해법는 단백질의 1차 구조를 분석하는 목적으로 광범위하게 쓰이는 방법이다.PTC(phenylisothiocyanate)법이라고도 하며 그 반응을 아래의 그림에 나타내었다. Phenylisothiocyanate(PTC)를 pH 8∼9, 실온에서 peptide와 반응시키면 N-말단이 thiocarbamyl화 된 PTC-peptide가 얻어진다. 이것을 산성조건하, 예를 들어 trifluoroacetate(CF3COOH)와 반응시키면 N-말단 아미노산만 thiazoline 유도체로서 유리하고 나머지의 단백질부분은 분해하지 않고 남는다. Thiazoline 유도체는 이어서 환상구조를 만들어 PTH(phenylthiohydantoin)가 된다. PTH 아미노산은 ethylacetate로 추출하여 각종 크로마토그래피로 동정할 수 있다. 미분해로 남은 peptide 또는 단백질은 계속해서 다음의 N-말단 동정에 사용할 수 있다. 최근에는 이 일련의 반응을 자동화한 장치(peptide sequencer)도 시판되고 있으며 조건이 맞으면 N-말단으로부터 60 아미노산잔기 정도는 단기간에 배열을 결정할 수 있다.- 이탈된 PTH로부터 N-말단 아미노산의 구조를 알 수 있다.- 짧아진 peptide 사슬은 두번째 Edman 분해가 가능하다.- 연속적으로 N-말단 아미노산을 절단하면서 분석한다.- peptide 사슬을 구성하는 아미노산의 연결 순서를 알 수 있다.- Edman 분해법의 주요 시약은 Phenylisothiocyanate이다.Limitations of Edman degradation method최대 30주기가 가능하지만 일반적으로 practice에서 15~20주기까지만 가능하다→ Reason is the efficiency of the chemistry. E.g. If each cycle is 98% efficient it means that by the 20th cycle the PTH-amino acid produced will be 60% or (0.98²? th) of the PTH of the first cycle.Edman 분해법 이용1. 세포내 히스톤 메틸화 수준 조절인자 규명순수 정제된 효소는 Edman Degradation 또는 MALDI-TOF Mass를 이용하여 아미노산 서열을 결정 하고, 이를 토대로 Genome Database에서 염기서열 정보를 얻고, PCR을 통해 유전자를 클로닝한다. Bacterial expression vector에 삽입하여 재조합 단백질을 얻어 in vitro 효소 활성에 이용하여 기질특 이성 등에 대한 기초적인 연구와, 다른 단백질과의 상호결합에 관한 연구를 진행한다. 또한 mammalian expression vector에 삽입하여 세포내 히스톤 메틸화의 생리기전을 연구한다.2. Edman degradation는 널리 펩티드와 단백질 시퀀스 분석에 사용이러한 이유로, Edman degradation은 과학을 생화학 및 생물 의학 분야에서 매우 중요한 도구가 되었 다. phenyl isothiocyanate는 일반적으로 Edman degradation에 대한 고용이지만, 더 민감한 Edman 시약이 필요했다. 최근 케이 이마이와 그의 동료들은 fluorogenic Edman 시약 개발했다.이는 다음과 같은 장점을 가지고 있다.(1) 안정 및 non - 형광 이전 derivatization 한다.(2) DBD-carbamoyl(CA) amino acids는 안정되고 강도가 강한 형광을 가지고 있다.(3) DBD-CA amino acids는 반대 상 HPLC 칼럼에서 분리하고 하위 picomole 수준에서 감지되었다.(4) 아미노산 순서의 결정과 D/L-아미노산 구성에 사용된다.(5) 아미노산 그룹의 fluorogenic 라벨 시약으로 사용된다3. Edman Degradation는 polypeptide의 기초 구조를 결정하는데 사용된다.4. DNA Sequencing의 단백질 1차 구조 결정Automated N-terminal sequencer 즉, N-terminal에서부터 sequencing을 하여 아미노산의 서열을 알아내는 방법이다. 여기서는 Edman's reagent라고 알려진 Phenylisothiocyanate를 이용한다. 이 용액 은 Alkali 조건에서 peptide의 N-terminus와 결합해서 PTH(phenylthiohydantoin)를 형성하고 PTH가 형성되면 불안전하기 때문에 펩티드 결합이 깨지게 된다. 그러면 떨어져 나온 PTH-의 질량을 측정해 어떤 아미노산인지 찾아낼 수 있다. 하지만 이 방법은 sequencing을 50개 이상 할 수 없다는 한계가 있다.만약 특정 효소를 처리하여 하나의 peptide를 여러개의 fragment로 나누면, 위의 Edman's method를 이용해 50여개의 아미노산을 알아내도 그 아미노산이 어디에 위치해 있는지 그리고 어떤 fragment가 먼저인지 파악하기가 힘들고 단지, 잘려진 fragment의 제일 앞 부분의 아미노산의 위치만 알 수 있다. 그러므로 처음에 처리해준 효소와는 다른 화학물질을 처리해서 peptide를 잘라주어 Edman's method를 하여 각각의 fragment들의 아미노산을 50개 가량 찾을 수 있다. 그럼 처음 했던 실험의 frament들의 아미노산 서열과 두번째 실험의 fragment들의 아미노산 서열을 비교해보면 겹치는 sequence가 있을 것이고 이 sequence를 통해 fragment의 위치를 알 수 있다. 이렇게 계속 다른 화학물질로 잘라서 Edman's method를 해서 비교해 보면 겹치는 sequence가 나타날 것이고 이들을 조합하여 peptide의 아미노산 sequence를 알아 낼 수 있다.

자연과학| 2011.09.21| 3페이지| 1,500원| 조회(956)

단백질, PTC, Edman, Edman 분해법, phenylisothiocya..

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생식세포분열, 극체, 수정

1. 생식세포분열 (meiosis)- 연속적으로 분열함으로써 염색체 수가 반감(haploid; n)된 딸세포가 형성되는 과정→ 염색체 수가 반으로 감소한다. 감수분열 때 염색체를 복제했던 세포는 연속해서 제1차 및 2차 감수분열을 하여 2회 분열한다. 즉, 초기에 염색체는 1회 복제한 후에, 2회 연 속해서 감수분열 함으로써, 결국 염색체 수는 복제되기 전의 염색체 수보다 2배로 감 소한다.- 반수체의 생식세포는 수정과정을 통하여 본래의 염색체 수(2n)를 갖는 새로운 개체를 형 성→ 감수분열에서는 상동염색체간에 유전물질의 교환이 일어난다.이러한 현상을 교차(crossing over)라고 하며 제1차 감수분열 전기에 일어난다.제1차 감수분열 전기 5단계① 세사기(leptotene stage): 염색체가 응축② 접합기(zygotene): 상동염색체가 짝을 이룸 (2가 염색체)③ 태사기(pachytene): 교차(crossing over)④ 복사기(diplotene): 4n→2n⑤ 이동기(diakinesis): 적도판에 배열하기 시작태사기의 교차(crossing over)교차결과 ? 유전적 재조합? 단백질 종류의 변화? 유전적 다양성 초래키아스마(chiasma)염색체는 감수분열 중기까지 4개의 염색분체로 이루어지며, 후기에 그 접합면 또는 종렬면에서 나누어지는데, 그 때까지 염색분체 사이에서 부분적 교환이 일어난다. 이것을 키아스마라고 하며, 키아스마의 빈도나 위치는 생물의 종류에?따라 특이적이다. 키아스마를 생성하기 위한 유전자의 교환을?교차(crossing over)라고 한다.교차(crossing over)로 인한 영향?1. 감수분열 후에 두 종류(♂, ♀)의 생식세 포가 만들어진다.2. 대부분의 염색체는 수천개 이상의 유 전자를 포함하고 있기 때문에 한번의 교차만으로도 많은 유전자에 영향을 준다.3. 다양한 개체가 만들어진다감수분열이 잘못되면?- 때때로 비정상적인 염색체 수를 가짐으로써 질병을 보이는 경우가 있는데, 다운증후군 은 21번 염색체가 하나 더 있음으로써 유발된다.- 이러한 비정상적인 염색체수는 비분리가 원인인데, 제1감수분열 때 상동염색체 쌍이 나눠지지 않거나, 제 2 감수분열 때 염색분체가 나눠지지 않음으로써 일어난다.2. 극체 (polar body)- 난자는 난모세포라는 세포에서부터 만들어진다. 난모세포는 두 개로 나뉘는 분열을 두 번 거쳐 4개의 세포로 쪼개어진다. 이때 난자가 될 세포 하나가 영양분과 세포기관이 포함된 세포질을 모둔 갖는다. 반면 나머지 3개의 세포는 아주 적은 양의 세포질을 가 기게 되어 매우 작은 세포가 된다. 이를 극체라고 한다.제1극체- 아직 성숙하지 않은 생식세포를 제1난모세 포라고 한다. 이것이 생식세포분열의 제1 감수분열을 하면 2가염색체 분리가 일어나 제1극체와 제2난모세포로 나뉜다.- 제1극체는 제2난모세초에 비해 크기가 매 우 작기 때문에 제2난모세포의 세포질에서 방출되는 방식으로 나타난다.제2극체- 제2난모세포가 생식세포분열의 제2감수분 열을 거치면 제2극체ㅣ와 난자로 나뉜다.- 제2극체 역기 난자에 비해 크기가 매우 작 기 때문에 난자의 세포질에서 방출되는 방 식으로 나타난다. 이 과정에서 제1극체도 분열을 하기 때문에 모두 3개의 극체가 만 들어진다.→ 극체는 난자와 동일한 염색체를 가지지만 세포질이 적기 때문에 생식능력은 없다.3. 수정 (Fertilization)- 반수체(Haploid)의 두 배우자, 즉 난자와 정자가 융합하여 배수체(diploid)의 접합자 (Zygote)가 되는 것- 발생학적 의미 : 반감 되었던 염색체수가 원래대로 복원하여 자연스럽게 양친의 유전형 질이 혼합되어 자손에게 유전되는 현상

자연과학| 2011.09.21| 4페이지| 1,000원| 조회(236)

염색체, 생식세포분열, meiosis

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인, 마그네슘, 황의 흡수와 대사, 체내기능. 필요량/함유식품, 결핍증 및 과잉증

인, 마그네슘, 황의 흡수와 대사, 체내기능. 필요량/함유식품, 결핍증 및 과잉증무기질은 신체에서 필요로 하는 양에 따라 다량 무기질과 미량 무기질로 분류한다.하루 필요량이 100mg이상이면 다량 무기질, 100mg미만이면 미량 무기질로 분류한다.인, 마그네슘, 황은 다량 무기질에 속한다.인- 신체 내 모든 조직에 존재, 인은 칼슘 다음으로 체내에 많음- 칼슘과 함께 골격과 치아를 구성하는 주요 무기질85%는 인산칼슘으로서 뼈와 이에 존재하고 나머지는 인지질·핵산으로서 모든 조직을 구성함- 골격 무기질 내 인과 칼슘의 비는 보통 1:2를 이룸 (바람직한 칼슘과 인의 섭취 비율 = 1:1)음식물 속의 인산화합물은 소화에 의해 무기 인산염이 되어 흡수됨영양 소요량으로서 1인 1일당 1g.인의 흡수와 대사인의 대사인산은 소장에서 흡수되며 활성비타민 D에 의해 흡수가 촉진된다. 칼슘이나 알루미늄 이온이 과잉으로 공존하면 흡수가 저해된다.식품 내에서 인산명의 형태로 존재하던 인은 가수분해 되어 알칼리 조건에서 인산염이 용해되지 않으므로 인의 흡수는 산성 조건을 유지하는 위와 소장 상부에서 이루어진다.비타민D는 인의 흡수를 돕는다.- 식품 중에 유기화합물의 인산염 형태로 존재- 장에서 소화되어 무기인으로 유리된 후 소장에서 흡수- 흡수율 - 50~70%- 칼슘, 인 - 흡수 경쟁과량의 칼슘은 인의 흡수저해, 과량의 인은 칼슘의 흡수를 저해- 인을 보유하는 주요 조직 - 골격과 골격근- 인은 주로 신장을 통해 배설이것이 혈중 인 수준을 조절되는 주요 기전- 부갑상선 호르몬의 농도가 증가 → 인의 배설량 증가인의 체내기능인은 체내에 거의 대부분이 인산의 형태로 존재하며 산화적 인산화에 의한 ATP의 생성, creatine phosphate의 생성 등 고에너지화합물을 형성하여 세포의 에너지 대사에 중요한 요소로 작용한다.- 골격과 치아의 형성뼈와 치아에 함유된 인은 전체의 약 80%를 차지한다. 인의 함유량은 혈액 40㎎/㎗, 혈청 4∼7㎎/㎗(소아), 3∼4.5㎎/㎗(성인)문입니다. 따라서 불균형적인 식사습관을 가진 사람에게서 드물게 인의 결핍이 있는 정도입니다. 인의 결핍은 각종 효소의 기능을 억제할 수 있으며, 뼈에서 칼슘의 과다로 인해 오히려 골의 연화를 촉진시킬수 있습니다.과잉증- 인이 과잉 → 칼슘과의 길항작용으로 칼슘결핍의 증상 초래인 함량이 많은 식품의 과잉 섭취와 최근 들어 가공식품과 탄산음료의 과잉섭취로 인해 인의 농도가 증가할수 있습니다.인이 과다하면 칼슘과의 길항작용으로 칼슘결핍의 증상을 초래할 수 있습니다.특히 가공식품과 탄산음료의 섭취를 줄여야 합니다.마그네슘- 마그네슘은 인체에서 4번째로 풍부한 무기질- 성인에 약 25g이 존재이 중 약 50~60% 정도는 뼈에 존재하며, 약 30%는 세포 내액에 함유되어 있고, 약 1% 정도가 세포 외액에 존재한다. 골격 마그네슘의 1/3은 세포 외액의 정상적인 마그네 슘 농도를 유지하는 마그네슘 저장고로서 작용한다.혈청 마그네슘 농도는 0.75~0.95mmol/L이며,세포내액의 마그네슘 농도는 0.3~1.0mmol/L로 일정하게 유지된다.- 동물과 식물에 모두 풍부흡수와 대사- 흡수율은 40~60%정도이나 섭취가 부족할 경우 80%까지 증가다량의 칼슘 섭취 시에는 마그네슘 흡수가 감소될 수 있으며, 곡류 외피에 있는 피틴산은 마그네슘과 불용성의 염을 형성하여 흡수율을 감소시킨다. 또한 식이 섬유소가 많은 식사에서는 마그네슘의 생체이용율이 낮아질 수 있다. 마그네슘 흡수를 약간 높일 수 있는 인자로는 비타민 D와 25(OH)D, 1,25(OH)2D 등 비타민 D의 대사물들이 있다.- 대부분 소장 흡수소장에서 수동적인 흡수와 능동적인 흡수 모두 일어난다.- 배설은 주로 담즙을 통해서 일어나고, 1/3은 소변으로, 나머지는 대변으로 배설- 신장은 혈중 마그네슘 농도를 조절하는 주요 장기혈중 마그네슘 농도가 낮으면 소변으로 배설되는 양이 감소한다사람에서 혈청 마그네슘의 약 75%는 사구체에서 여과되는데, 여과 장애가 생긴 경우에는 신장의 세뇨관으로 이동되는 마그네슘의 양이 se와 pyrophosphatase의 부활제이다.300종 이상의 효소체계에 있어 보조인자(cofactor)로서 작용하며, 혐기적 및 호기적 에너지 생성과정에서 Mg-ATP 복합체의 일부로서 또는 직접 효소를 활성화시킴으로써 작용한다. 또한 지방, 단백질 및 핵산의 합성, 근육의 수축 등 체내에서 일어나는 생화학적 혹은생리적 과정에도 필요하다. 이외에도 마그네슘은 신경 및 근육의 세포막 전위의 유지와 신경근 연접부에서의 충격전도에도 필수적인 역할을 한다. 마그네슘은 또한 Na, K-ATPase활성에도 필요하며, 심장근육세포 내에서 세포외로 칼륨이 운반되는 것을 조절한다.- 에너지 대사에 관여마그네슘은 에너지대사 반응에 관여하며 ATP 의존성 인산화반응에서 효소의 기질은 ATP-Mg(1:1)의 복합체입니다. 마그네슘은 ribosome의 응집, mRNA의 70S ribosome으 로의 부착에 작용하여 단백질 합성을 도우며 DNA의 합성과 변성, cAMP의 생성에 관여 합니다.- 신경자극의 전달과 근육의 긴장 및 이완작용 조절마그네슘은 칼슘, 포타슘, 소디움과 함께 신경자극전달과 근육(심근, 내장근)의 수축 및 이완작용을 조절하는 네 가지 양이온 중의 하나로, 마그네슘과 칼슘은 서로 상반된 작용 을 합니다. 칼슘은 신경을 흥분시키고 근육을 긴장시키는 반면, 마그네슘은 신경전달 물 질인 아세틸콜린의 분비를 감소시키고 분해를 촉진하여, 신경을 안정시키고 근육의 긴장 을 이완시킵니다. 따라서 마그네슘은 마취제나 항경련제의 성분으로 이용되기도 합니다.- ATP의 구조적 안정 유지Mg는 세포내에서 에너지-원으로 되는 가장 중요한 효소 ATP-ase를 활성화합니다. Mg 이 기질인 ATP와 결합하여 이 복합체에 ATP-ase가 작용하여 에너지를 생산합니다.- 위 내의 HCL의 구성 성분- 혈액과 체조직의 수분량 조절- 체액의 산, 알칼리 균형 유지에 필요- DNA와 RNA 합성에 관여Mg는 세포내 입자의 하나인 단백질의 합성에 중심적인 역할을 담당하고 있는 리보솜을 응집하는 작의 성장장애와 골다골증 등이런 증상은 혈중 칼슘 농도가 낮아져 저칼슘혈증이 나타나 근육경련, 고혈압, 관상혈증 과 뇌혈관의 경련이 일어날 수 있다. 이는 나트륨과 칼슘 펌프의 손상으로 인해 신경세포 기능이 비정상적으로 되기 때문에 나타난다. 또한 마그네슘은 골격과 무기질의 항상성에 중요한 역할을 하며 골격세포의 기능뿐만 아니라 뼈의 수산화인회석 결정의 형성과 성장 에 직접적인 영향을 주기 때문에, 마그네슘 결핍은 폐경 후 골다공증 발생의 요인이 될 수도 있다.[과잉으로 인한 건강 장해] :- 요독증과 같은 신장질환, 부갑상선 기능 항진, 정신장해, 부신 기능 저하, 신장기능 저하된 경우에 고마그네슘 혈증(허약, 구역질, 호흡이 느려지고, 혼수상태 심하면 죽음) 등이런 마그네슘 과잉 섭취는 식품 중에 고유로 함유되거나 강화된 마그네슘은 유해영향을 보이지 않으므로 마그네슘의 상한섭취량은 식품 외(주로 하제, 보충제, 제산제 등 약리적 목적)급원 섭취량에 국한합니다.한편 노인은 식욕부진, 치아 문제, 부실한 식사 등으로 인해 마그네슘 섭취가 낮은 편이 며 또한 흡수율도 감소되어 마그네슘 결핍이 일어나기 쉬우므로 주의해야 한다. 이 밖에도 이뇨제 사용자, 알코올 중독자, 당뇨병이나 더운 기후에서 몇 주간 심하게 땀을 흘리거나 장기간의 설사나 구토시 결핍될 수 있다.필요량 / 함유식품필요량- 우리나라 마그네슘 필요량성인의 경우 남성 285㎎/day, 여성 235㎎/day마그네슘 평균필요량은 ㎏ 체중 당 필요량에 표준체중을 적용시켜 구한 값이다권장섭취량은 평균필요량의 120% 수준으로- 우리나라 마그네슘 권장섭취량성인의 경우 남자 340mg/day, 여자 280mg/day마그네슘의 영양소기준치(DV)는 220mg30세를 기준으로 나이가 많아짐에 따라 10~20mg/day정도 증가일반적으로 성인의 마그네슘 섭취는 영양섭취기준의 80%정도로 다소 부족한 경향50세 이상 성인과 노인의 경우에는 표준체중이 낮아짐에도 불구하고 계속적인 신장 기능의 감소를 고려하여 30~49세 성보조효소로 작용하는 티아민, 비오틴 리포산, 코엔자임 A의 구성성분- 타우린은 담즙산과 결합하여 타우로콜산로 존재한다.- 산화환원반응에 관여황은 시스테인, 글루타티온, 지방산 등에서 -SH기를 형성하여 생체의 산화환원반응에 관 여하고 효소의 활성원자단으로 작용합니다. 즉 파파인, 알코올탈수소효소, 석신산탈수소효 소, 글리세르알데히드-3-인산디하이드로게나아제 등의 효소는 -SH기가 활성원자단으로 서 기질에 작용하며 이들은 p-클롤로머큐리벤조산, N-에틸말레이미드 등의 SH 시약, 수 은과 같은 중금속, 산화제 등에 의해 실활합니다.- 산,염기 평형에 관여- 해독작용아미노당, steroid, phenol, tyrosine, 방향족아민 등의 수산기나 아미노기에 황산기를 부 가하여 불활성체로 변화시켜 접합 해독하는 황산접합체 형성에 의한 해독에 관여합니다.- 고열량 황결합 형성결핍증 및 과잉증결핍증발견 안됨과잉증가능성 없음필요량결정되어 있지 않음1. 개요마그네슘은 체내기능을 유지하는데 빠뜨릴 수 없는 미네랄로효소를 활성화하며 특히 당질대사를 활발하게 한다.또한 심장의 긴장완화에도 필요한 미네랄이다.칼슘과 균형이 중요하며 칼슘의 2분의 1에서 3분의 1이필요량이지만 워낙 체내량이 적어 부족하기 쉬운 영양소이므로주의해야 한다.체내함량 / 20-30g. 하루 필요량 /남성310mg, 여성 250mg2. 돌연사의 가장 큰 원인, 마그네슘 부족시합 중의 사고를 방지하려면 ‘마그네슘’이라는 미네랄이 부족해지지 않도록 각별히 신경 써야 한다. 쥐내림, 손떨림이나 허탈감, 이유 모를 우울함, 경련은 마그네슘이 부족하다는 신호다. 그것을 알아차리지 못하고 계속 마그네슘이 부족한 채로 지내면 돌연사 같은 돌이킬 수 없는 사태가 벌어지고 만다. 칼슘이 결핍된 상태에서 인산염이 많은 식사를 하면 뼈에서 칼슘이 빠져나와 활성산소의 손상을 받은 동맥에 침착되어 경화가 진행된다. 거기에 콜레스테롤이 축적되면 동맥의 벽이 두꺼워지고 흡사 호스 안쪽에 불순물이 찬 것 같은 상태가 된다.그렇게 되면에 유용

자연과학| 2011.09.21| 12페이지| 1,500원| 조회(1,505)

결핍증, 체내기능, 함유식품, 인 필요량, 과잉증

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Gene Cloning

※목차1. 실험 목적2. 실험 방법 및 과정1) 염분노출(저염분)2) 해부3) RNA 추출하기4) RNA 농도 측정5) cDNA 합성6) PCR(Polymerase chain reaction) - 유전자 증폭 단계7) 전기영동8) Gel Purification9) Ligation10) Transformation11) Pick up12) 집균13) 효소처리3. 실험 결과4. 고찰Gene Cloning1. 실험 목적- Gene cloning을 통해 DNA를 자르고 붙이고 변형시켜서 실험에 필요한 재조합 DNA(recombinant DNA)를 제조하고 Southern, Northern, cell culture 실험 등에 사용해야 할 생체 내 유전자를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 기본적인 효소의 처리와 DNA의 분리 및 조작방법을 배울 수 있다. 그리고 정상과 저염분 노출시킨 fish의 DNA를 비교 분석한다.2. 실험 방법 및 과정- 실험 대상 : Cinnamon Clownfish, 농어목 자리돔과, 열대성 해수어1) 염분 노출(저염분)① 실험 설계 - 35(Control) → 17.5 psu② 처리 시간 - 24h③ Sampling - 1조 : Control, 2조 : 17.5 psu뇌, 아가미, 간, 장, 근육, 생식소 채취2) 해부해부하기 위하여 마취제로Cinnamon Clownfish를 마취하는 단계마취된 Cinnamon Clownfish의 모습(무게 4.7g, 전장 6cm, 체장 4.5cm, 체구 2.5cm)해부를 할때 항문을 따라 잘라나간다.(내장 파괴를 보호하기 위해 최대한 겉으로만 자른다)Sampling인 뇌, 아가미, 간 장, 근육, 생식소 채취한 모습각각 튜브에 조직을 넣고 on ice(초저온 -80℃)상태로 보관한다.(실온에서 보관하면 조직이 파괴되기 때문이다)3) RNA 추출- 조직 : 아가미 (아가미 조직은 사용하는 이유는 염분의 영향을 가장 많이 받는 조 직이기 때문이다.)- 원심분리기 4℃, 20min, 13500rpm으로 준비- 모든 실험 (70%에서 살균력 가장 효과적)⑭ 원심분리 5분→ 다시 RNA만 추출하기 위해서이다.⑮ RNA를 제외한 나머지 액은 버린다.RNA를 제외한 나머지 액을 버린 후스핀다운→ 튜브 벽에 뭍어 있는 RNA까지 깨끗하게 모으 기 위함? DEPC 20μl 넣고 Vortex→ DEPC : 뭉쳐져 있는 RNA를 풀어주는 역할(튜브1 : DEPC 20μl 첨가, 튜브2 : DEPC 150μl 첨가 [피펫팅을 잘못하여 샘플2에 과 량 첨가])? -80℃에서 보관한다.4) RNA 농도 측정큐벳 안에 빛을 투과하여 농도 측정하는 기계(흑광기)발현량을 비교하기 위해서Normalize 2.5μg/μl튜브 1 : 0.4950μg/μl튜브 2 : 0.1438μg/μl5) cDNA 합성- 준비 : water bath 70, 42℃ 설정① DEPC 10μlRNA 1μl (2.5μg/μl)Oligo dT 1μl Total 12μl→ DEPC (튜브1 : 6μl, 튜브2 : 0μl)RNA (튜브1 : 5μl, 튜브2 : 11μl) (농도 2.5μg/μl를 맞기 위해)(튜브2에는 계산하면 11μl보다 많은 양을 넣어야 하지만 토탈 12μl를 맞추 어야 하기 때문에 11μl를 넣었다.)→ Oligo dT : Primer역할분리한 RNA 중 mRNA는 모두 cDNA로 만들어진다.② 70℃ 10분→ 튜브 전체를 감싸줘서 가열RNA와 Oligo dT가 반응하여 붙게 해 준다.③ on ice 1분→ 반응을 중지시키는 역할④ 10x PCR buffer 2μl10mM dNTP 1μl0.1M DTT 2μlM-MLV 0.5μl→ 10x PCR buffer : 시약들이 반응하게 해주는 완충제 역할10mM dNTP : 염기서열을 잇는 염기재료0.1M DTT : 단일가락인 RNA가 서로 붙는 것을 방지M-MLV : 역전사효소로 A-T, G-C를 붙게 하는 역할, 열에 강하다⑤ 42℃ 1시간 → 붙여주는 시간⑥ 70℃ 15분 → 이어주는 시간⑦ on ice 1분 → 반응을 정지시키는 시간⑧ 37℃ 20분 → 정지 되하는 부위를 잘라낸다.8) Gel Purification준비- water bath 50℃ 설정① Gel 무게 3배만큼 GB buffer→ 샘플1 샘플2겔 0.05g 0.05g튜브 0.78g 0.78g총 0.83g 0.83g② 50℃에서 약 10분정도 완전히 녹임(중간 중간 vortex)→ Gel과 DNA를 분리시키기 위하여 녹임③ Gel 무게만큼 iso propanol (50μl)→ iso propanol : DNA를 잡아주므로 Gel과 DNA를 분리④ Vortex⑤ Spin column에 옮기기Spin column에 중간부분의 흰천에 DNA가 남고 나머지는 아래로 빠진다.⑥ 실온에서 centrifuge 1분⑦ 맨 밑에 액 버림⑧ NW buffer 750μl→ NW buffer : DNA를 세척해주는 역할⑨ 실온 5분 방치⑩ 실온에서 centrifuge 1분→ DNA만 남는다⑪ 맨 밑에 액 버리고 빈튜브 다시 한번 실온에서 centrifuge 1분⑫ Spin column을 새 1.5ml 튜브에 넣기⑬ EB buffer 15μl→ EB buffer : DNA를 희석시켜 주는 역할⑭ 실온에서 1분 방치 후 centrifuge 1분⑮ Spin column 버림9) LigationLigation buffer 2.5μlVector 0.5μlDNA 1.5μlLigase 0.5μl Total 5μl실온에서(22℃) 3시간 동안 반응→ Vector : 대장균에 DNA를 삽입시키는데 필요한 운반체로서, 세포 내에서 자가 복제을 한다.Ligase : Vector와 DNA를 붙여주는 역할→ Ligation한 후 Vector와 DNA와 연결된 상태에서의 DNA는 플라스미드DNA라함10) Transformation준비 - 대장균, 고체배지, spreader① 대장균 80μl에 ligation한 DNA를 모두 넣는다→ 대장균 : 살짝 슬러쉬 상태로 만들어서 실험하고 열에 매우 민감하여 항상 on ice 상태를 유지하고 빠른 시간내에 DNA를 대장균에 옮겨야 한다.② 얼음에서 10분간 l→ S1 : 세포벽을 깨주는 역할로 세포벽을 군데군데 무너뜨림그리고 이때 세포막은 유지되도록 한다.⑥ Vortex⑦ S2 250μl→ S2 : 세포막을 깨주는 역할로, 크기가 큰 chromosomal DNA가 너무 잘게 조각 나는 것을 방지하면서 용액에 DNA를 노출시킨다.⑧ Inverting (5번정도 흔들어준다.)⑨ S3 350μl→ chromosomal DNA를 엉기게 하는 역할로, pH를 급격히 7.0까지 복구시켜 크 기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있던 plasmid는 비교적 renaturation 이 잘 되지만, chromosomal DNA는 미처 renature되지 못하고 엉기게 된다.⑩ Inverting한 후 15분간 Centrifuge⑪ 상층액을 Spin column에 옮기기→ plasmid DNA 추출⑫ 실온에서 1분간 Centrifuge⑬ 하층액 버리기⑭ PW 750μl→ PW : plasmid DNA을 세척해 주는 역할 (washing)⑮ 실온에서 1분간 Centrifuge한 후 하층액 버리고 한번 더 Centrifuge? 맨위의 튜브를 1.5ml 새튜브에 옮긴 후 EB 30μl→ EB : plasmid DNA를 희석시켜 액화상태를 만들어줌? 1분간 실온 방치 후 실온에서 1분간 Centrifuge → 맨 위의 튜브 버리기→ plasmid DNA만 남음11) 효소처리SDW 7μlEcoRI buffer 1μlEcoRI 0.5μlPlasmid DNA 1.5μl Total 10μl37℃ incubator에서 2시간 동안 효소처리 반응 후 전기영동 확인→ EcoRI(제한효소)를 처리시켜 Vector와 DNA를 분리시킴3. 실험 결과- Gene cloning 과정 요약해부조직별로 기능이 다르듯이 그 조직을 구성하는 세포의 유전자 발현도 다르므로 원하는 유전자에 따라 조직을 취하는 과정Transformation원하는 유전자의 결합한 Vector를 대장균에 삽입↓ ↓RNA추출DNA에서 유전정보를 가진 exon과intron이 존재 어야 하는데 심플2에는 피펫팅을 잘못하여 150μl정도가 들어가 RNA의 농도가 낮아져서 cDNA 합성할 때 악영향을 미쳐 전기영동한 결과 원하지 않은 물질도 함께 발현되었다.저염분 노출시킨 Cinnamon Clownfish의 전기 영동한 product의 밴드가 정상인 Cinnamon Clownfish의 전기 영동한 product의 밴드보다 더 진하게 발현되어 나와야 한다. 그 이유는 저염분 노출시킨 Cinnamon Clownfish이 Nak에 더 활성화 되기 때문에 전기영동할 때 Na, K이온이 많이 왔다갔다하여 더욱 진하게 발현하여 나온다.- 대장균 배양 결과대장균을 배양한 결과 대장균이 거의 나오지 않았다. 그 이유는 도말과정에서 대장균이 열에 노출되어 활성을 잃어서일 것이다.우리가 원하는 대장균은 흰색을 띤다.조교 선배님이 배양한 대장균.우리조와 확연한 비교가 되는 사진이다.만약 우리조도 열에 노출 되지 않도록 잘 했더라면 이런 좋은 결과가 나왔을 것이다.- Transformation과정에서 Ampicillin 처리한 결과Plasmid에는 antibiotics resistance gene이 포함되어 있어 항생제가 포함된 배양접시에서는 Plasmid가 들어가지 않은 cell은 사멸하여 colony를 생성하지 못하고 Plasmid가 들어가 있는 cell이 colony를 생성한다. 이 중에서 우리가 원하는 gene이 제대로 들어가 있는 것을 확인하기 위해서는 LacZ를 이용한 colcor selection이다.- IPTG/X-Gal을 처리한 결과LacZ의 MCS에 DNA가 재조합되지 않은 colony는 LacZ가 제기능을 하여 X-Gal을 대사시키므로 푸른색이 되고 DNA가 재조합된 colony는 LacZ가 망가져서 기능하지 않아 X-Gal이 그대로 남아 있어 흰색이 된다.- 전기영동Ⅱ빨간색 박스로 표시된 부분은 Vector가 포함되어 Marker를 통해 Vector의 길이가 3000bp정도로 확인되었고 파란색 박스로 표시된 부분 insert는 600bp로 회였다.

자연과학| 2011.09.21| 14페이지| 1,000원| 조회(276)

DNA, gene cloning, Recombinant DNA

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난발생

넙치학 명 : Paralichthys olivaceus분 류 : 척색동물문 > 조기강 > 가자미목 > 넙치과정의, 어원 및 같은 이름같은 이름 광어(남한 일대), 넙(고저), 褐牙?, Hirame(ヒラメ)특징눈은 몸의 왼쪽에 치우쳐 있고, 두 눈 사이는 넓고 편평하다. 아래턱이 위턱보다 조금 앞쪽으로 돌출되어 있고 위턱의 뒤끝은 눈을 훨씬 지난다. 입은 크며 경사져 있고, 양턱에는 날카로운 송곳니가 1줄로 나있다. 등지느러미는 위쪽 눈 앞 가장자리보다 조금 앞쪽에서 시작하며, 꼬리지느러미는 중앙이 뾰족하게 돌출된 첨치형이다. 측선은 가슴지느러미 부위에서 등쪽으로 활처럼 휘어져 있지만, 가슴지느러미가 끝나는 지점에서 일직선으로 된다. 눈이 있는 쪽은 빗비늘로 매우 작고, 눈이 없는 쪽은 둥근 비늘이다. 눈이 있는 쪽은 황갈색 바탕에 작고 큰 짙은 갈색 점이 고루 분포하며 모든 지느러미는 짙은 갈색 혹은 황갈색을 띤다. 눈이 없는 쪽은 희다. 최대 전장 85cm 까지 성장한다.분포가. 분포 : 우리나라 연근해, 일본 연근해, 동중국 연근해- 서 식 지 : 수심 10~200m- 서식수온 : 15~27℃- 적 수 온 : 15~26℃나. 성장 : 1년 15~30cm5년 50~76cm최대 85cm생태가. 성숙과 산란- 산 란 장 : 천해의 수심 20~70m(자갈밭, 암초지역)- 산란수온 / 산란철 : 11~23℃ / 봄~여름 (2월~6월)- 산란형태 : 다회성 산란형- 산 란 량 : 1회 20~70만립 정도(분리부성란, 난의 크기 : 직경 0.9mm전후)나. 발생과 성장- 부화가능수온 : 10~24℃- 부화 적수온 : 14~29℃- 부화소요시간 : 15℃ 에서 50~60시간 소요다. 먹이- 식 성 : 포식성- 먹 이 : 작은 어류, 갑각류, 새우류, 갯가재류◈ 실험1. 실험 목적넙치 알의 수온별 발생과정을 알아보자2. 실험기구넙치 알, 대형 수조 1개, 비커 1개, 온도계 1개, 스포이드 1개, 현미경 2개3. 실험방법① 대형 수조에 1/2~2/3정도 물로 채운다.② 온도계를 설치한 후 얼음을 이용하여 수온을 15℃로 맞춘다.(항상 15℃를 유지해야 되므로 수온이 올라가기 않도록 주의해야한다)③ 넙치 알이 든 비커를 온도를 맞춘 대형 수조에 넣는다.④ 넙치 알을 30분마다 일정량을 빨아들여 현미경으로 관찰한다. (저배율 → 고배율)- 한번에20~30개정도 관찰하는 것이 적당하다.- 물이 너무 많거나 적으면 관찰이 잘 되지 않으므로 적당히 조절한다.⑤ 상태 변화가 있을 때마다 기록한다.4. 관찰- 관찰시간 : 14일 오후 8시부터 16일 오전 11시까지- 산란시간 : 14일 오전 10시 30분- 수 온 : 15℃《넙치의 난발생과정》수정란 → 2세포기 → 4세포기 → 16세포기 → 상실기 → 포배기 → 낭배기 → 체절형성 → 안포형성 → 심장박동, 색소포형성 → 부화상실기 5/14 pm 8:00 5/14 pm 9:00pm 9:00 진행률13개중 10개 77%난할이 어느 정도 진행되어 큰 할구들로 이루어진 뽕나무 열매(오디)와 같은 모양의 배가 형성되는 시기이다. 그리고 두 그림은 다른 모양을 하고 있지만 같은 상실기이다. 보는 위치에 따라 다른 것을 보여주고 있다.포배기 5/14 pm 11:00진행률 23개 중 19개 (83%)난할이 진행되면서 할구는 더 작아지고 개수가 증가하며 배반엽과 난항 사이에 빈 공간(포배강)이 형성되는 시기이다. 분열이 진행되면서 그 면적이 넓어져 난황의 표면을 덮는다.낭배기 5/15 am 1:00진행률 31개 중 17개 (55%)배반엽이 알의 상반부를 덮게 되면 배환의 한 부분이 안쪽으로 굽어져 함입되어 주머니 모양이 되는 시기이다. 낭배기 초기에는 2층의 세포층이 나타나는데 바깥쪽층을 외배엽(ectoderm)안쪽층을 내배엽(endoderm)이라 하고, 나중에 그사이에 중배엽(mesoderm)이 발달된다.체절형성 5/15 am 8:30진행률 36개중 20개 (56%)낭배기에서 체절을 형성하는데 가장 많은 시간이 걸렸다. 이 체절은 나중에 척추와 근육으로 된다고 한다.안포형성 5/15 am 10:30머리에 안포(optic vesicle)가 형성부화직전 5/16 am 10:00 부화 5/16 am 10:30온도유지가 되지 않아 수조의 온도가 19℃였다. 넙치 알의 거의 대부분이 부화 직전이나 일부 부화단계였다.부화한 넙치가 꼬리를 움직이는 것을 관찰하였다. 원래 온도를 15℃를 계속 유지 시켰더라면 부화단계까지 도달하지 않았을 것이다.5. 고찰이번 실험은 넙치알이 수온별로 발생과정에서 어떤 차이가 있는가를 알아보는 실험이었다. 15℃, 20℃, 25℃로 나누어 관찰하였는데 우리 조는 15℃에서의 넙치알의 발생과정을 관찰하였다.넙치알 수정은 14일 오전 10시 30분에 이루어졌고 관찰은 오후 8시부터 시작되었는데 우리가 관찰할 때 2세포기, 4세포기, 16세포기 과정이 미리 지나가고 상실기단계에 돌입한 시기였다. 상실기 전 단계를 관찰하지 못한 것이 아쉬웠다. 우리 조는 수조의 온도를 15℃를 유지시키기 위해 얼음을 사용하였다. 우리는 온도 유지를 하는 것에 많은 신경을 썼는데 어류에게는 1℃차이라도 큰 변화를 느끼기 때문이다. 처음에는 관찰하면서 현미경을 잘 다루지 못하여 관찰하는데 많은 어려움이 있었지만 바로 조교 선배님이 현미경 사용법을 알려주어서 관찰하는데 불편함이 없었다. 관찰은 30분마다 하였고 첫날 14일 밤까지는 진행이 빨리 되어 시간 가는 줄 모르고 정신없이 관찰하였다. 처음에 관찰 하였을 때의 모양과 한시간 후인 9시에 관찰한 모양이 달라 다른 단계인 줄 알았지만 수업시간에 교수님께서 말씀하셨던 보는 위치에 따라 그 모양이 다르다는 강의 내용이 생각나 조교 선배님의 조언으로 알을 굴려서 다시 관찰해보니 같은 상실기였다는 것을 알 수 있었다. 그리고 그날 밤에 교수님께서 우리를 위해 간식을 사와 주셔서 맛있게 먹고 기운이 나고 피로도 풀렸다. 15일 새벽부터는 진행속도가 느려서 처음보다 여유롭게 관찰할 수 있었다. 그리고 15일 아침에 관찰이 끝났을 무렵에 25℃와 우리조가 15℃에서의 넙치알의 발생과정의 차이가 확연하게 나는 것을 보고 수온이 15℃보다 높은 25℃에서 넙치알의 발생과정 속도가 빠르다는 것을 알 수 있었다. 그리고 우리는 15일 10시 30분에 집으로 돌아가서 꼬리형성과 심장박동을 관찰하지 못하여 아쉬웠다. 하지만 다음 날인 16일에 와서 심장박동과 꼬리가 형성되어 부화하려는 넙치알을 관찰 할 수 있었다. 그리고 관찰을 하였는데 우리 조는 온도가 높았던 3~6조에 비해 폐사율이 낮았다. 넙치알이 죽었는지 쉽게 알아보는 방법은 넙치알은 부성란이기 때문에 물에 뜬 것은 살아 있는 것이고 물 속에 가라앉아 있는 것은 죽을 것이다. 이것으로 보아 온도가 높으면 알의 발생속도는 빨라지지만 세균이나 바이러스의 발생도 쉽게 일어나 폐사율도 같이 높아진다는 것을 알 수 있었다. 15일 아침까지 다른 수온으로 관찰하는 조와의 발생과정에서 차이가 있었지만 16일 아침에 와서 관찰을 하였을 때는 모든 조가 부화직전이거나 부화된 상태였다. 차이가 없는 이유는 15일 아침부터 16일 아침까지 수온조절을 해주지 못해서 일 것이다. 계속 15℃를 계속 유지 하였다면 부화시간은 50~60시간에 부화했을 것이다. 그리고 심장이 띠고 꼬리가 움직이는 것을 볼 수 있었다. 그때서야 1cm도 되지않은 것도 생명체라는 것을 느낄 수 있었다.

자연과학| 2011.09.21| 5페이지| 1,500원| 조회(233)

넙치, 광어, Paralichthys olivace, 넙

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