A+ 생화학실험 <11주차. DNA Sequencing (DNA 염기서열분석)> 레포트

소개글

안녕하십니까.

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목차

1. Title
2. Purpose
3. Theory
4. Chemicals & Apparatus
5. Procedure
6. Data & Result
7. Discussion
8. Reference

본문내용

1. Title
11주차. DNA Sequencing (DNA 염기서열분석)
2. Purpose
Sequencing의 원리를 이해하고, 이를 직접 수행하여 cloning이 제대로 이루어졌는지 확인한다.
3. Theory
3.1 Sanger sequencing
Sanger sequencing은 1977년, Frederick Sanger에 의해 개발된 방법으로, DNA 서열의 정밀한 분석을 가능하게 한다. 특히 500bp 이하의 DNA 조각에서 약 99.99%의 매우 높은 정확도로 서열분석한다. 이 방법은 DNA 중합 과정 중 템플릿 DNA에 상보적인 염기가 결합하는 원리를 활용한다. ddNTP가 DNA 중합을 중단시키고 이러한 중단 지점들을 분석하여 DNA 서열을 결정하는 방법이기 때문에, 이 과정이 연쇄 중단 반응을 기반으로 하고 있어, 이를 chain termination method 또는 dideoxy nucleotide termination method라고 부른다. Sanger sequencing에서 사용되는 중요한 물질인 ddNTP는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP와 구조적으로 유사하지만, 3’-OH 그룹이 없어 중합이 한 번 일어난 후 추가적인 nucleotide의 결합을 방지한다.
각 튜브에는 같은 농도의 ssDNA 템플릿, 중합을 시작할 프라이머, dNTP, 그리고 sequenase를 넣고 DNA 중합 반응을 진행한다. 이후 반응 중에 각각의 튜브에 ddNTP(ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)를 dNTP의 1/100 비율로 추가함으로써, 각각 다른 속도로 중합이 이루어져 다양한 길이의 DNA 분자가 생성된다. 이러한 과정에서 무작위로 추가된 ddNTP가 중합 반응을 중단시킨다. 각 튜브에서 중단된 서열들은 polyacrylamide gel 전기영동을 통해 크기별로 분리한 후, X-ray 필름을 사용하여 서열을 확인한다.

참고 자료

Jeremy MB, Biochemistry 8th ed, Freeman, 2015, pp. 143~150, pp. 177~189.
Witsanu S, Thae TM, Montarop Y, et al, Correction to: Production and applications of fluorobody from redox-engineered Escherichia coli, Appl Microbiol Biotechnol , 2023, 107, p. 1959.