ligation과 kit을 이용한 mini prep

소개글

A+로 점수 잘 받은 실험 레포트입니다.

목차

1.Abstact

2.Introduction
(1)ligation
(2)self-ligation 방지법
(3)vector의 종류
(4)mini prep

3.material and method

4.Result

5.Discussion

본문내용

이번 실험의 목적은 제한효소로 처리하여 얻어낸 insert DNA를 pET21a vector에 넣은 후 확인하는 것으로 ligation product을 C cell에 형질전환하고 colony을 선택한다. plasmid DNA를 mini prep(kit)을 통해 정제하고 추출한 뒤 Agarose gel상에서 전기영동하여 vector DNA insert DNA를 분리한다. ligation이란 DNA를 접합하는 것이다. 이번 실험에서 T4 DNA ligase을 사용하며 이는 T4 bacteriophage에서 유래된 것으로 ATP, Mg2+를 cofactor로 사용하여 5’-P와 3’-OH 간 phosphodiester bond를 형성해서 DNA를 접합한다. Vector의 self-ligation을 방지하는 방법으로는 double digestion, vector의 5’end에 대해 dephosphorylation해주는 방법이 있다. 이번 실험에서는 두개의 제한효소를 이용하여 double digestion했다. Mini prep의 전체적인 실험 순서는 Resuspension step, Lysis & denaturation step, Neutralization & renaturation step, EtOH, Isopropanol precipitation step순이다. 실험방법으로는 <Table.1>처럼 조성하여 형질전환 하고 열충격과 냉각을 가해주고 원심분리하여 ampicillin agar plate에 도말하여 colony을 확인한다. 이후 mini prep(kit)을 통해 plasmid DNA를 정제, 추출하여 제한효소 처리하고 전기영동을 통해 vector와 insert DNA를 분리하여 확인한다. 실험결과, <Fig.2>의 아래 사진처럼 vector only와 vector-insert ligation 모두 colony가 관찰되지 않았다. 원인으로는 vector와 insert가 tube안에 잘 들어가지 않았거나, 도말 시 너무 고온이라 세포가 죽은 것이라 생각된다.

참고 자료

Wiley, Sherwood, Woolverton ,2016 ,"미생물학 제9판“,라이프사이언스,137~174p, p358~372
왓슨, 2014,왓슨 분자생물학 7판, 양재섭, 바이오사이언스 출판,pp153~159
캠벨, 2019, 캠벨 생명과학 11판, 전상학, 바이오사이언스 출판,pp 402~405