Real-time PCR

최초 등록일
2019.08.26
최종 저작일
2018.05
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목차

1. 실험관련 질문
1) mastermix에 SYBR이 있는 이유와 원리
2) 기계가 실시간으로 읽을 수 있는 이유와 원리
3) depc water가 무엇인지
4) FORWARD PRIMER와 REVERSE PRIMER들이 TARGET DNA에 어떤식으로 붙어서 증폭이 되는지 어떤 온도에서 PRIMER들과 DNA POLYEMRASE들이 어떤식으로 작용하는지 자세하게 그림으로 표현하기
5) melt curve와 melt peak가 뭔지 자세히 조사, 왜 이 그래프가 중요한지 이유
6) 증폭이 잘 되지 않았다면 어떤 원인이 있었을까, target이 없는데도 증폭이 되었다면 무슨 이유가 있었을까, 왜 증폭되는 그래프는 s자형으로 나올까

2. primer design
1) DNA 변성
2) 프라이머 결합
3) DNA 합성

3. 고찰

본문내용

1. 실험에 필요한 DNA와 primer들을 사용 전에 미리 녹여놓는다.
2. Real time PCR tubes에 real time용 mastermix와 DNA, primary들을 넣는다.
3. primer들과 DNA의 권장량 (이번 실험에서는 20L reaction할 것이므로 mastermix는 2배 농축된 것이니까 10L를 넣어준다. forward primer, reverse primer 1L를 넣고 template DNA는 4.5L 를 넣는다.)
4. 보통 mastermix는 10L, template DNA는 개, primer들은 10pmole/L 1L로, 이들을 넣고 20L를 맞추기 위해서 depc water를 넣어준다.
5. 광학적으로 읽기 위해 투명한 필름을 위에 덮어 붙이고 내용물이 나오지 못하게 한다.
6. centrifuge를 5분간 돌려서 안에 있는 기포들을 제거해준다.
7. 준비된 plate를 real-time PCR기계에 넣고 돌린다.

* 실험관련 질문
1 ) mastermix에 SYBR이 있는 이유와 원리
Real-time PCR은 PCR 과정 중 실시간 증폭되는 산물의 양을 수치화함으로써 샘플에 존재하는 기질의 초기량을 정확히 정량화 할 수 있는 가장 진보된 방법이다. (증폭산물의 검출은 PCR 반응에 첨가하는 형광물질을 이용) 실험 방법에 따라 증폭되는 DNA의 양을 직접 측정하는 방식과 (SYBR green이나 Evergreen과 같은 DNA binding dye를 이용) probe DNA 조각을 첨가하여 생성되는 형광을 수치화하는 Taqman 방식이 존재한다.

참고 자료

없음

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