Transformation & Isolation of plasmid DNA

최초 등록일
2019.05.22
최종 저작일
2019.04
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목차

1. Introduction

2. Purpose

3. Materials

4. Procedures(Transformation)

5. Procedures(DNA mini prep)

6. Procedures(Gel Electrophoresis)

7. Results(Transformation)

8. Results(Gel Electrophoresis)

9. Discussion
1) transformation mechanism; 어떻게 플라스미드가 세포 내로 들어가는가?
2) 전사 속도를 어떻게 조절하는가?
3) 유전자 재조합에서 plasmid의 역할은?

10. Reference

본문내용

transformation은 외부 DNA를 숙주 세포 내로 집어넣어 세포가 새로운 유전 형질을 추가로 얻게 하는 것으로 유전자 재조합에 이용된다. heat shock 또는 electroporation 방법을 이용해 진행되는데 heat shock은 CaCl₂, RbCl₂를 처리한 competent cell(물리적, 화학적 처리를 통해 세포막을 약화시켜 외부 DNA의 세포 유입을 용이하게 만든 cell)과 도입할 DNA에 순간적인 열 충격을 주어 세포막의 투과성을 일시적으로 변화시키는 방법으로 이를 통해 외부 유전자의 세포 유입을 용이하게 만든다. CaCl₂, RbCl₂의 양이온들은 음전하를 띠는 세포막을 중화시켜 음전하를 띠는 DNA와 척력이 작용하지 않도록 돕는다. 한편 electroporation은 salt 농도가 낮은 competent cell에 강한 전기적 충격을 주어 순간적으로 세포막을 깨뜨리고 이를 통해 세포막의 투과성을 변화시켜 DNA를 세포 내로 도입하는 방법이다. transformation 효율은 높지만 특수한 장비가 필요하기 때문에 본 실험에서는 heat shock을 이용한다.
DNA prep은 DNA를 소량 추출하는 것으로 주로 alkaline lysis method를 이용해 진행된다. seed에 EDTA가 들어간 resuspension solution을 넣어 세포벽을 유지하는 필수 성분인 칼슘 이온을 제거해 세포벽을 무너뜨리고 NaOH가 들어간 lysis solution을 처리해 DNA를 변성시킨다. 이후 glacial acetic acid가 들어간 neutralization solution을 넣어 DNA를 재결합시킨 후 원심분리를 하는 방법으로 DNA를 분리해낸다. 본 실험에서는 chromosomal DNA와 plasmid DNA의 구조 원리 차이를 이용해 plasmid DNA만 분리한다. 선형의 이중나선 구조를 지닌 chromosomal DNA와 달리 plasmid DNA는 supercoiled 형태를 지닌다.

참고 자료

John Garbutt, 『Essentials of Food Microbiology』, Arnold Publishers
정동효, 『식품공학』, 유한문화사

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