[생명과학실험]Specific activity and enzyme kinetics of alkaline phosphatase

목차

1. 실험 목적
2. 실험 이론 및 원리
3. 실험 기구 및 시약
4. 실험 방법
5. 실험 결과
6. 토의 사항
7. 참고 문헌

본문내용

1.1. 정제 후 단백질을 확인하는 방법에는 항원항체 반응을 이용하는 western blot과 효소의 활성도를 비교하는 방법이 있다.
1.2. Spectrophotometer
일반적으로 빛이 물체와 만나면, 물체의 표면에서 반사되거나 물체에 흡수되거나 물체를 통과한다. 이 중 빛의 흡수현상을 이용하여 시료 용액 중의 빛을 흡수하는 화학물질의 양을 정량할 수 있다. 주로 자외선이나 가시광선 영역에서의 빛의 흡수되는 정도를 측정하는데 빛이 시료를 통과하게 되면 일부 흡수되기 때문에 빛의 광도가 달라짐을 이용한다. 물체에 흡수되는 빛의 양은 흡광물질의 농도마다 다르기 때문에 흡광도를 통해 흡광물질의 농도를 알 수 있다.

<중 략>

1.1. Bradford assay (단백질 정량)
1.1.1. 정제한 AP sample 중에서 AP가 가장 많이 검출될 것이라고 추정되는 sample을 1개 고른다.
→ 실험자는 200-1을 선택하였다.
1.1.2. BLANK를 만든다.
→ DW 800㎕ + Bradford 200㎕ = BLANK 1㎖
1.1.3. PM과 200-1을 가지고 흡광도를 측정할 solution sample 1, 2를 만든다.
→ PM 1㎕ + DW 799㎕ + Bradford 200㎕ = sample 1 1㎖
→ 200-11㎕ + DW 799㎕ + Bradford 200㎕ = sample 2 1㎖

<중 략>

PNPP가 AP에 의해 분해되어 황갈색을 띠는 PNP를 생성하는 것을 관찰하는 것이었다. 또한 그 정도를 UV-visible spectrophotomer를 이용하여 흡광도를 알아내 sample에 들어있는 AP의 양을 추정해보는 실험을 하였다. 실험을 이해하는 데에 있어서는 큰 어려움은 없었으나 실험을 수행하는 데에 있어 숙련도가 떨어지는 실험자들에 의해 실험이 진행되었기 때문에 과정상의 오류가 발생할 확률이 크다. 이제 위의 실험 결과를 토대로 실험 전반에 관하여 논하여 보자.

참고 자료

Principles of Biochemistry & ㏖ecular Cell Biology, David L. Nelson, Michael M. Cox, Harvey Lodish, W.H. Freeman & Company, 2008.07.01., p.91-92, p.195-199