DNA cloning (Gate way system, T-vector) PCR 원리와 방법 실제로 어떻게하는지 자세한설명

최초 등록일
2016.04.17
최종 저작일
2016.04
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- 수정 가능 내용 – 거의다 맞는 이야기지만 디스커션내용이 들어가있기 때문에 잘확인하시면서 자신만의 완벽한 Protocol을 만들게 도움이 될 것입니다.
한참 공부하고 찾아보고해서 적은 것이지만 완벽히 맞는 내용을 적은 것은 아닙니다.
그 이유는 실험을 실제로 하였을 때 사람마다 다른 점이 많기 때문에 그러한 상황까지 잘 고려하였습니다.
아무쪼록 많은 도움이 되길 바랍니다.
Protein의 full sequence를 찾아서 사용할 것.

⎫ T-overhangs for Easy PCR cloning (TA cloning) with Taq polymerase
1. 장점으로 Cloning 전용 vector로 알려져 있는 T vector(T-overhangs for Easy PCR cloning)를 사용할 경우 T(티민)이 sticky하게 5’에 붙어있기 때문에 Taq polymerase를 이용한 PCR에 의해 형성된 insert에는 3’에 A(아데닌)이 붙어 있어서 attl 부위를가지고있는 아무 destinated Vector(pFlag, pHA등)에 insert를 쉽게 넣을 수 있는 장점이 있다
2. T-vector는 Phosphate와 Topoisomerase의 Tyr-274번의 결합에 의해 서로 ligation이 되는 것이 막아주는 역할을 하고 있다. 때문에 T-vector는 linearization되어 있고, Circular 형태가 아니다.
3. 다른 장점 중 하나는 Blue/White selection이 가능한 (Lac Z) 가 삽입되어있어서 쉽게 cloning이 된 DNA를 포함한 bacteria colony를 찾을 수 있고. T7, SP6 부위(?)는 reverse와 forward transcription이 가능하다.
4. 단점은 cloning후 실제로 사용할 vector로 또 옮겨야 되는 번거로움이 있기 때문에 시간이 조금 오래 걸린다.
5. Size는 3Kb vector로써 3~4 Kb정도의 DNA를 insert를 최대치로 사용할 수 있다고 한다.

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