PCR을 이용한 Genomic DNA isolation 과 DNA amplification

최초 등록일
2014.06.18
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2012.03
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대장균으로부터 얻은 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하는 실험입니다.

목차

1. 실험목적
2. 실험방법
3. 실험결과
4. 고찰

본문내용

<실험 목적>
세포로부터 추출한 genomic DNA를 PCR로 증폭해 보고 DNA의 추출원리와 PCR의 원리에 대해 이해한다.

<실험 방법>
① 세포가 들어있는 현탁액으로부터 1mL을 취해 1.5mL 튜브에 담는다.
② 3분간 원심분리한 후, 상층액을 버린다.
③ 침전물에 DW를 1mL 가한 후, resuspending 한다.
④ 30초간 원심분리한 후, 상층액을 버린다.
⑤ 침전물에 TE buffer를 200uL가한 후, resuspending 한다.
⑥ 항온수조에 5분간 둔다.
⑦ 상온에서 충분히 식힌 후, 10분간 원심분리 한다.
⑧ 상층액을 취해, UPW, dNTP, primer, polymerase, 10x buffer가 섞인 용액에 넣는다.
⑨ 용액을 94℃에서 가열하여 dsDNA의 수소결합을 깨고, 50℃으로 식혀 annealing시키고, 72℃에서 전사시키는 일련의 과정을 25회에서 30회 반복한다.
⑩ 결과물을 전기영동하여 DNA의 size를 확인한다.

<중 략>

가장 먼저, 실험에서 PCR로 증폭하기위한 genomic DNA를 얻기 위해 세포벽을 파괴해야 했다. 이 방법으로는 열을 이용한 물리적 방법을 사용하였다. cell suspension으로부터 cell만을 얻기 위해, 원심분리 과정을 거치고 항온수조에서 가열하였다. 열로 인해 파괴된 세포벽으로부터 나온 gDNA가 DNase에 의해 분해되는 것을 막기 위해 TE buffer를 사용했다. TE buffer의 EDTA는 DNase의 조효소인 금속이온을 chelation하는 역할을 함으로서 gDNA가 파괴되는 것을 막는다. PCR과정은 template DNA를 denaturation하는 것으로 시작된다. 열로서 수소결합을 파괴한 후, ssDNA를 만들어 여기에 primer를 annealing한다.

참고 자료

없음

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