[생화학 실험보고서] Sub 클로닝, 원형플라스미드 DNA 지도제작

소개글

Restriction mapping을 통해 미지의 plamid의 restriction site를 결정한다. Mini preparation을 위해 E. Coli에 transformation을 수행하는 실험입니다.

목차

1. 목적
2. 원리
3. 시약 및 기자재
4. 실험방법
5. 실험결과
6. 고찰
7. 참고문헌

본문내용

1. 목적
Restriction mapping을 통해 미지의 plamid의 restriction site를 결정한다. Mini preparation을 위해 E. Coli에 transformation을 수행한다.


2. 원리
1) Agarose gel electrophoresis
Agarose는 D- and L-galactose가 선택적으로 결합한 polymer 형태로 gelation되어 3차원적으로 직경이 50 nm ~ 200 nm에 이르는 그물망을 형성하게 된다. 이러한 agarose gel은 주로 상대적으로 큰 DNA 절편(0.5 ~ 25kb)을 분리하는데 이용된다. DNA가 이러한 gel을 통해 이동하는 것은 DNA의 phosphate group에 의해 주어진 negative charge가 gel상에 주어진 전기장의 양극 쪽으로 끌림에 의해 가능하게 된다. 이러한 원리는 protein의 electrophoresis와 유사하지만 한 가지 차이점은 핵상의 경우 4종류의 nucleotide가 상대적으로 골고루 분포하고 있으며 분자 내 모든 전하가 phosphodiester group으로부터 유래하기 때문에 전하 / 질량비(charge to mass ratio)가 분자의 길이에 비례한다는 점이다. 결국 DNA의 migration 속도는 DNA의 molecular size와 conformation에 의해 결정되는데, DNA는 size가 작으면 작을수록 또한 좀더 compact하면 할수록 빠른 속도로 gel을 통과해 이동한다. DNA 분자는 gel에서 specific한 dye인 ethidium bromide에 의해 관찰된다. Ethidium bromide는 평평하고 hydrophobic한 분자구조를 가지고 있어서 double strand DNA의 stacking된 base pair 사이로 미끄러져 들어가 (intercalation) 자외선에 노출되었을 경우 오렌지색 형광을 나타내 DNA절편을 gel상에서 관찰할 수 있게 된다. Agarose gel electrophoresis에서 분리하려는 DNA의 크기에 따라 gel의 agarose 함량이 달라지는데 그 함량은 다음과 같다.

Agarose ( % (w/v))
DNA가 분리되는 크기의 범위(kb)

참고 자료

없음