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1. 단백질 연구를 위한 실험 기법
1.1. Bradford assay를 이용한 단백질 정량
Bradford assay를 이용한 단백질 정량은 단백질 연구에서 매우 중요한 실험 기법이다. Bradford assay는 단백질을 정량, 즉 시료 내에 포함된 원하는 단백질의 양 또는 농도를 결정하기 위해 진행하는 실험이다.
Bradford assay의 원리는 Coomassie Brilliant Blue G-250 (CCB) 염료가 단백질의 방향족 아미노산 곁사슬과 결합하면서 흡광도가 변화하는 것을 이용한다. CCB 염료는 단백질과 결합하면 청색으로 변하게 되는데, 이때의 흡광도 변화를 측정함으로써 단백질의 농도를 간접적으로 결정할 수 있다.
실험 방법으로는 먼저 세포를 용해시켜 단백질을 추출하고, 농도를 알고 있는 BSA (Bovine Serum Albumin) 단백질을 기준으로 standard curve를 작성한다. 그 후 미지의 농도를 가진 단백질 시료를 Bradford assay에 적용하여 흡광도를 측정하고, standard curve에 대입하여 시료 내 단백질의 농도를 결정한다.
Standard curve 분석 및 단백질 농도 결정 단계에서는 정확한 단백질 농도를 결정하기 위해 다양한 농도의 BSA 표준 용액을 이용하여 선형 검량선을 작성한다. 미지의 단백질 시료에 대한 흡광도 측정값을 이 검량선에 대입하여 단백질 농도를 역으로 계산할 수 있다. 이때 발생할 수 있는 오차를 최소화하기 위해 정규화된 BSA 농도값을 사용하여 표준 검량선을 그리는 것이 중요하다.
실험 결과 분석 단계에서는 standard curve의 편차 및 R-squared 값 분석을 통해 실험 데이터의 신뢰성을 확인한다. 또한 미지 농도의 단백질 시료에 대한 분석 결과를 토대로 실험에 사용할 단백질의 적절한 양을 결정할 수 있다.
종합적으로 볼 때, Bradford assay는 단백질 정량에 널리 사용되는 기본적인 실험 기법으로, 시료 내 단백질의 농도를 정확하게 결정하는 것이 후속 실험의 성공을 위해 매우 중요하다. 따라서 실험 과정 전반에 걸친 세심한 주의와 데이터 분석을 통해 신뢰할 수 있는 결과를 도출해내는 것이 필수적이다.
1.2. SDS-PAGE를 이용한 단백질 분리
SDS-PAGE를 이용한 단백질 분리는 단백질의 크기에 따라 분리하는 방법이다. 단백질을 SDS(sodium dodecyl sulfate)로 변성시켜 모든 단백질이 동일한 음전하를 띠게 하고, 전기영동을 통해 단백질의 크기에 따라 분리할 수 있다.
SDS-PAGE의 원리는 다음과 같다. 우선 단백질 시료에 SDS와 환원제를 처리하여 단백질의 2차, 3차 구조를 파괴한다. SDS는 단백질의 아미노산 잔기에 결합하여 음전하를 띠게 하고, 환원제는 이황화결합을 끊어 단백질을 선형 구조로 만든다. 이렇게 변성된 단백질은 SDS에 의해 음전하를 띠게 되므로, 전기영동 시 크기에 비례하여 이동하게 된다. 즉, 작은 단백질일수록 빨리 이동하고, 큰 단백질일수록 느리게 이동한다.
SDS-PAGE 실험 방법은 다음과 같다. 먼저 acrylamide와 bisacrylamide를 중합시켜 polyacrylamide 겔을 만든다. 겔은 상부의 stacking gel과 하부의 separating gel로 구성된다. Stacking gel은 낮은 농도(4-6%)의 acrylamide로 이루어져 있어 단백질을 농축시키고, separating gel은 높은 농도(10-12%)의 acrylamide로 이루어져 단백질을 크기별로 분리한다.
시료를 loading한 후 전기영동을 하면 단백질이 크기에 따라 분리된다. 겔을 꺼내어 단백질을 염색하면 밴드로 확인할 수 있다. 염색에는 Coomassie Brilliant Blue, Silver staining, SYPRO Orange 등 다양한 방법이 사용된다.
단백질의 상대적인 분자량은 전기영동 시 이동거리와 분자량 표준물질의 이동거리를 비교하여 결정할 수 있다. 이동거리와 분자량의 관계는 대체로 선형이므로, 표준물질의 분자량에 대한 이동거리 그래프를 작성하면 미지 단백질의 분자량을 추정할 수 있다.
SDS-PAGE는 단백질 혼합물에서 특정 단백질의 존재 여부를 확인하고, 단백질의 상대적인 분자량을 분석하는데 널리 사용된다. 또한 Western blot 실험의 전단계로 활용되어 단백질을 분리하는데 사용된다.
1.3. Western Blot을 이용한 특정 단백질 검출
Western Blot을 이용한 특정 단백질 검출은 SDS-PAGE로 단백질을 분리한 후, 분리된 단백질을 막에 옮겨 특정 단백질에 대한 항체를 이용하여 검출하는 방법이다. 이는 단일 단백질과 단백질 변형의 질적 검출을 위해 생화학에 광범위하게 사용된다.
Western Blot 과정은 크게 4단계로 이루어진다. 첫째, SDS-PAGE로 단백질을 분리한다. 둘째, 분리된 단백질을 막으로 옮기는 transfer 과정을 거친다. 셋째, 1차 항체와 2차 항체를 이용하여 특정 단백질을 검출한다. 넷째, 검출된 단백질을 가시화하는 단계이다.
특히 1차 및 2차 항체 반응 단계에서는 다음과 같은 과정이 이루어진다. 1차 항체는 관심 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로, 차단제를 처리하여 비특이적 결합을 방지한 후 막과 배양한다. 이후 1차 항체와 결합할 수 있는 2차 항체를 처리하는데, 2차 항체는 보통 효소나 형광물질 등의 검출 표지자와 결합되어 있다. 이를 통해 1차 항체가 결합한 단백질을 간접적으로 검출할 수 있게 된다. 2차 항체 처리 후에는 세척 과정을 거쳐 결합되지 않은 항체를 제거한다.
단백질 검출 및 visualization 단계에서는 2차 항체의 표지자를 활성화시켜 단백질 밴드를 가시화한다. 예를...
