본문내용
1. 미생물의 염색 및 관찰 (Gram staining)
1.1. 실험 목적
그람염색의 화학적, 이론적 기초를 파악하고 그람 양성과 음성의 미생물을 구분할 수 있다는 것이 이번 실험의 목적이다. 그람 양성균과 그람 음성균의 세포벽 구조 차이를 이해하고, 이를 바탕으로 염색 양상이 다르게 나타나는 원리를 파악하고자 한다. 또한 그람염색 과정을 실제로 수행해보고 현미경을 통해 두 균주를 관찰하여 구분하는 능력을 기르고자 한다.
1.2. 실험 재료 및 기구
실험 재료 및 기구는 "알코올 램프, 캔들 라이터, 페이퍼타올, 70% 알코올, 증류수, Agar plate에 하룻밤 기른 미생물, 18-24시간, 2종류, 유산균(그람양성), Inoculation loop, 네임펜, 마이크로파이펫, 파이펫팁, 슬라이드 글라스, 커버글라스, 현미경, 그람염색키트, Petri dish"이다.
1.3. 실험 과정
실험 과정은 다음과 같다. 첫째, 증류수를 Slide glass 위에 한 방울 떨어뜨리고 균을 loop로 덜어 도말한다. 둘째, 공기 중에서 건조시킨다. 셋째, 알코올 램프 위를 통과시켜 열로 고정시킨다. 넷째, Crystal violet으로 1분간 염색한다. 다섯째, 증류수로 washing한다. 여섯째, Iodine으로 1분간 처리한다. 일곱째, 증류수로 washing한다. 여덟째, 알코올로 10~20초 탈색한다. 아홉째, 증류수로 washing한다. 열째, Safranin으로 1분간 염색한다. 열한 번째, 증류수로 washing한다. 열두 번째, 공기 중에서 건조시킨다. 열세 번째, 광학현미경으로 관찰한다."
1.4. 그람염색법
1.4.1. 그람염색법의 단계적 원리
그람염색법의 단계적 원리는 다음과 같다.
첫째, 제 1단계인 크리스탈 바이올렛 염색 단계에서는 염기성 색소인 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet)으로 염색하면 그람 양성 및 음성균 모두 자주색으로 염색된다.
둘째, 제 2단계인 착색 단계에서는 크리스탈 바이올렛으로 염색된 세균에 요오드 용액을 처리하면 크리스탈 바이올렛과 요오드가 반응하여 세포 내에 불용성 복합체(크리스탈 바이올렛-요오드 복합체, CV-I)를 형성한다. 따라서 그람 양성 및 음성 세균 모두 자주색으로 여전히 보인다.
셋째, 제 3단계인 탈색 단계에서는 착색된 세균에 탈색제인 알코올 시약을 처리하면 착색된 CV-I 복합물이 용해된다. 이때 그람 양성균과 음성균은 서로 다른 반응을 보인다. 그람 양성균의 경우에는 복합물이 세포벽 내에 그대로 남아 있지만, 그람 양성균은 탈색된다. 따라서 탈색 단계가 지나면 그람 양성균은 자주색이지만 음성균은 백색으로 보인다.
넷째, 제 4단계인 대비 염색 단계에서는 분홍색의 염기성 색소인 사프라닌(safranin)으로 대비 염색을 하면 백색으로 탈색되었던 그람 음성균은 사프라닌의 색인 분홍색으로 염색된다. 그러나 자주색으로 염색된 그람 양성균은 영향을 받지 않고 그대로 자주색으로 보인다.
이처럼 그람염색법은 세균의 세포벽 구조에 따라 다른 염색 반응을 보이도록 하여 그람 양성균과 그람 음성균을 구별할 수 있게 해준다."
1.4.2. 그람양성균과 그람음성균의 세포벽 차이
그람양성균과 그람음성균의 세포벽 차이는 다음과 같다.
그람양성균의 세포벽은 두꺼운 펩티도글리칸 층으로 구성되어 있다. 펩티도글리칸은 짧은 폴리펩타이드로 연결된 변형된 당의 중합체가 망상구조를 이루어 전체 세포를 둘러싸고 있다. 이러한 두꺼운 펩티도글리칸 층은 세포벽의 약 80-90%를 차지하며, 세포의 형태와 구조를 유지하는데 중요한 역할을 한다. 또한 그람양성균의 세포벽에는 테이코산이라는 산성 물질들이 포함되어 있는데, 이 테이코산의 인산기가 음전하를 띠어 세포 표면의 음전하에 영향을 미친다.
반면, 그람음성균의 세포벽은 그람양성균에 비해 매우 얇은 펩티도글리칸층(약 10%)과 외막으로 구성되어 있다. 그람음성균의 외막은 지질다당류(LPS), 지질단백질, 인산 등으로 이루어져 있으며, 이 중 지질A 부분이 내독소로 작용한다. 또한 외막과 내막 사이에는 약 15nm 두께의 세포주변질이 존재하며 높은 농도의 단백질을 포함하고 있다. 그람음성균의 세포벽에는 테이코산이 없으며, 대신 포린이라는 단백질이 세포막 내부와 외부로 수용성 물질을 이동시키는 역할을 한다.
요약하면, 그람양성균은 두꺼운 펩티도글리칸 층과 테이코산을 가지고 있어 내독소는 없지만 항생제에 감수성이 높은 반면, 그람음성균은 얇은 펩티도글리칸 층과 외막, 세포주변질, 지질다당류를 가지고 있어 내독성은 강하지만 항생제 내성이 강한 특징을 보인다.
1.5. 실험 결과 분석
최종적으로 A균이 자색으로 염색되었고 B균이 적색으로 염색된 결과를 통해, A균은 그람양성균이며 B균은 그람음성균이라는 것을 알 수 있었다"". 그람양성균은 세포벽의 펩티도글리칸 층이 두꺼워 크리스탈 바이올렛-요오드 복합체가 세포벽에 남아있게 되어 자색으로 염색된다. 반면 그람음성균은 세포벽의 펩티도글리칸 층이 얇아 알코올 탈색 과정에서 크리스탈 바이올렛-요오드 복합체가 빠져나가 대조염색제인 사프라닌에 의해 적색으로 염색된다"". 또한 3% KOH 용액을 통한 그람 판정 결...
