DNA sequencing

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DNA sequencing에 대한 발표자료입니다

목차

DNA 염기배열 결정법
Sanger-Coulson method
Maxam-Gilbert Method

본문내용

DNA 염기배열 결정법
DNA의 염기서열을 알아내는 것은 분자생물학 연구에 있어서 가장 기본적인 정보를 제공해 주는 중요실험
Dideoxy chain termination method
(Sanger method)
Chemical degradation method
(Maxam & Gilbert method)
Sanger-Coulson method (chain termination method)
1975년 영국의 Frederick Sanger 교수 연구팀 dideoxynucleotide를 사용
중합효소는 3’OH가 없는 ddNTP를 이용해서는 DNA를 합성할 수 없으므로(인산과 ester 결합이 안된) 각각의 ddNTP에서 합성이 끝나게 되는 원리 이용.
Chain termination method는 ssDNA가 필요하기 때문에 sequencing하려는 분자는 M13 vector를 이용하여 클로닝한다. Sequencing을 위해 다른 상보적 사슬을 중합해야 하므로 ssDNA를 사용한다. DNA 중합시 ddNTP (dideoxy NTP)를 이용하여 반응이 종료되게 한 후 전기영동으로 확인한다.
Sanger-Coulson method (chain termination method)
과정
1. Primer 준비, DNA polymerase가 중합을 하기 위해 필요한 3`-OH 제공한다. M13 특이적 promoter를 이용한다.
2. Synthesis of the complementary strand (M13 + primer + gene + DNA pol + dNTPs + ddATP) DNA 중합시에는 유사체를 넣으면 중합이 정지된다. ddATP의 경우 3`-OH가 없으므로 중합이 정지된다. 따라서 중합된 길이는 A가 들어갈 때마다 결정, 이들 가닥의 모든 끝은 A이다. 이때 ddATP와 dATP의 비를 잘 맞추어야 한다. ddATP가 너무 많으면 fragment가 짧아진다.
3. 마찬가지로 다른 ddNTP (ddCTP, ddTTP, ddGTP)를 이용하여 중합반응을 실시한다.
4. 이들을 각각 0.5mm polyacrylamide gel에서 전기영동 한다.
5. dNTP에 labeling된 방사선 동위 원소를 이용하여 짧은 밴드부터 읽는다.
Sanger-Coulson method (chain termination method)
Gel을 만드는데 많은 시간이 요구됨
Running time이 비교적 오래 걸림
Resolution을 높이기 위하여 gel을 얇게 만들어야 함
Polyacrylamide gel의 문제점
Sanger-Coulson method (chain termination method)
(Maxam & Gilbert method)

참고 자료

없음