이온통로 유전자의 클로닝, 발현, 이온통로 단백질 정제 및 전기 생리학적 특성 파악

소개글

이번 실험은 클로닝된 유전자를 T7 RNA polymerase를 이용하여 cRNA를 합성하고(in vitro transcription), 이종 발현계(hetero expression system)인 개구리 egg에 주입, 발현시켜 전위고정법(voltage clamp method)으로 이온 통로의 전기 생리학적 특성을 파악하는 것이었다.
pGEM-HEA라는 vector에 voltage-gated Ca2+ channel 중 하나인 α1H라는 유전자를 집어넣고 이를 E.coli에 주입시켜 영양배지에서 키웠다. 재조합 된 plamid DNA를 가지고 있는 E.coli로부터 plasmid DNA를 소량 분리하였는데 그 방법을 mini preparation이라고 한다. mini preparation를 통해 얻은 DNA를 RNA로 바꾸어주는 transcription 과정을 거쳤다.
transcription시킨 RNA를 개구리 egg에 auto injector를 이용해 injection한다. 개구리 egg는 하나의 세포로 이루어졌음에도 불구하고 우리 눈에 잘 보일 뿐만 아니라 closed system이고 튼튼하기 때문에 사용한다. Voltage clamp를 이용해서 current를 측정함으로써 칼숨 이온채널의 발현여부를 확인할 수 있다. 실험에서는 Ca2+대신 Ba2+을 사용하였는데 그 이유는 Ca2+가 세포 내에서 단백질에 활성을 갖게 하여서 작동 기작의 function이 바꾸기 때문에 더 정확한 실험을 위해 Ca2+와 charge carrier가 비슷한 Ba2+을 사용하였다.
Voltage clamp는 전위를 고정시켜 전위차를 유지하기 위해 흐르는 전류의 양을 측정함으로써 이온의 이동을 측정하는 방법으로써 칼슘이온채널이 발현되었는지를 확인할 수 있었다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
2_1. 세포막의 특성
2_2. 막 단백질의 종류
2_3. PCR (Polymerase chain reaction)
2_4. Voltage-Clamp
2_5. Channel protein
2_6. ion channel
3. Method
4. Data & results
5. Discussion
6. Reference

본문내용

중합효소 연쇄반응은 다음과 같이 세 단계로 이루어진다.
1) DNA의 변성(denaturation)
90°C∼96°C로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어야 한다.

2) Primer의 결합(annealing)
50°C∼65°C에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 일반적으로 사용되는 annealing 온도는 표 1과 같다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다.

3) DNA의 합성(polymerization)
70°C∼74°C에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000∼4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다.
위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다.


2_3_1. PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점

① Template DNA
선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal DNA나 전염성 병원체의 DNA 또는 RNA로부터 제조한 complementary DNA(cDNA), plasmid DNA 등을 쓸 수 있다. 불순물이 섞여 있으면 반응을 억제할 수 있으므로 가능한 한 정제하여 사용하는 것이 좋으며, 정제가 안된 경우에는 양이 적을때 반응이 충분히 일어나지 않고 양이 많으면 비특이적 반응이 일어나므로 주의해야 한다.
Chromosomal DNA인 경우 1 μg 이내, plasmid DNA의 경우 100 pg∼100 ng 정도를 일반적으로 사용하지만 사용하고자 하는 DNA 내에 증폭하고자 하는 target DNA의 copy 수에 따라 달라질 수 있다. 전기영동상에서 비특이 DNA가 나타나거나 끌린 모양이 나타나면 맨 먼저 template DNA양을 줄이는 것을 시도하는 것이 좋다.

② Primer
Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서 안쪽으로 약 20 bp 내외의 염기서열에 대응하는 oligonucleotide를 DNA 합성기로 합성하여 이용한다.
G+C 비율이 반 정도 되게 디자인하는 것이 primer와 template 간의 결합력을 강하게 유지하는데 도움이 되며 G+C 함량이 많을 경우에는 annealing 온도를 높이면 되지만, 무엇보다도 양쪽 primer의 annealing 온도를 비슷하게 만들어야 한다. 또한 양쪽 primer가 서로 상보적인 염기 결합이 일어나지 않도록 하고 가능하면 반응산물내에 있는 DNA 염기서열을 분석하여 비특이 DNA가 생성되지 않도록 고안해야 한다. Primer의 디자인이 PCR 반응의 성공 유무의 90%를 차지한다고 할 수 있기 때문에 합성하기 전에 신중히 고려해야 할 것이다. 가능하면 PAGE 정제된 primer를 쓰도록 한다. Primer의 양은 0.1~0.5 μM로 시행한다.

③ dNTP (deoxynucleotide triphosphate)
시약상에서 dATP, dCTP, dGTP와 dTTP(각각 100 mM stock)을 구입한 후 혼합하여 사용한다. 양은 target DNA의 길이에 따라 다를 수 있으나 각각 20∼200 μM 정도를 사용한다.

④ Taq DNA polymerase
Taq는 온천에서 사는 Thermus aquaticus라는 균주에서 따온 이름이다. 이 균의 활동 적정온도는 70°C∼74°C이며 95°C에서 40분이 지나도 50% 정도의 활성은 남아 있다. 이 효소가 발견되기 전에는 Klenow 효소를 이용하여 매 cycle마다 효소를 첨가해 주면서 반응을 시켜야만 했다. DNA 합성의 오차율은 1.1×10-4 bp로 DNA polymerase I의 오차율(1.0×10-5)보다 높는데 이는 Taq DNA polymerase가 잘못 들어간 nucleotide를 삭제하고 다시 합성하는 proofreading 기능(3`→5` exonuclease activity)이 없기 때문이다. 따라서 PCR 산물에서 유전자의 변이가 발견되더라도 반드시 확인과정을 거쳐야 한다. 한번의 반응에 사용하는 효소의 양은 보통 0.5-5 unit 정도인데 양이 너무 많으면 비특이 적인 DNA가 형성될 가능성이 많고, 너무 적으면 증폭 산물이 부족하게 되므로 최적 조건을 찾도록 노력해야 한다.

참고 자료

1) Kandel et al., Essentials of Neural Science and Behavior, 1995. pp 164-165
2) Weaver, Robert F, 분자생물학, 라이프 사이언스, 2003
3) Neil. A Cambell, Biology, 라이프사이언스, 2001, pp 64-68
4) Alberts 공저, 필수 세포 생리학, 교보문고, 2005, pp 388~403