Preparation of Antibodies & SDS-PAGE & Western blot

소개글

세포학에서 많이 사용하는 항체는 특정 항원에 해당하는 물질의 유무, 세포내의 분포, 많고 적음을 알 수 있는 좋은 시료이다. 이번 실험에서는 세포학 연구에 많이 쓰이는 항체를 얻기 위하여 쥐에 항원으로 GST(in BL21)를 injection하였다. Injection시 면역반응을 최대화하기 위하여 면역반응 촉진제로 Fruend`s Adjuvant를 사용하였는데, 첫 번째 접종에선 죽은 Mycobacterium을 포함한 Complete Freund`s Adjuvant(CFA)를 항원과 1:1비율로 섞은 후 사용하였다. 총 3주에 걸쳐 3번의 항원 injection이 이루어 졌는데 두 번째와 세 번째 injection시에는 Mycobacterium이 포함되지 않은 Incompete Freunds Adjuvant(IFA)를 항원과 1:1비율로 혼합하여 주입하였다. 이렇게 3주후에 3차 접종까지 끝낸 쥐를 잡아 ether로 마취시킨 후 배를 갈라 심장에 주사바늘을 찔러 혈액을 취하였다. 여기서 원심분리를 통해 얻어진 혈청을 immunobloting에 사용할 수 있게 1:1000으로 희석하였다. 아미노산, 단백질, 핵산등과 같은 하전된 물질들을 분리하는데 매우 효과적인 수단으로 이용되는 전기영동(electrophoresis)을 이용하여 단백질을 분리하였는데 SDS-PAGE를 이용하였다. Acrylmide와 bisacrylamide의 polymerization을 통해 만든 polyacrylamide gel을 이용하여 단백질과 같은 하전된 입자가 매우 뚜렷한 띠들로 분리될 수 있도록 변형한 방법인 discontinuous-gel electrophoresis에 SDS를 사용하여 단백질의 크기를 결정할 때와 단백질이 monomer인지 그렇지 않으면 oligomer인지를 결정할 때 유용하게 사용된다. 이 SDS-PAGE를 이용하여 GST의 분자량은 약 28 kDa임을 알 수 있었다. 이 분리한 gel상태에서의 항원 GST를 전기에 의해 nitrocellulose membrane에 transfer 한 후 쥐에서 추출한 serum을 western blot 시켜서 쥐에서 항원에 대한 항체가 생성되었는지 알아보았다. 이 immuno blotting 시에는 skim milk를 사용하여 비특이적인 결합을 막는 blocking을 하여야 한다. 쥐에서 뽑아낸 serum을 primary antibody로 사용하고 alkaline phosphatase를 secondary antibody로 사용하여 immuno blotting을 한 결과 쥐에서 GST에 대한 항체가 생성되었음을 알 수 있었다.

목차

Preparation of Antibodies & SDS-PAGE & Western blot
Abstract
Introduction
-Antibody
-Monoclonal antibody & polyclonal antibody
-Electrophoresis(전기영동)
-SDS gel electrophoresis
-Western blotting
Materials and Method
-Prepare of antibody
-SDS-PAGE
-Western Blot
-<면역염색법(immunostaining)>
Data & Result
Discussion
Reference

본문내용

Abstract
세포학에서 많이 사용하는 항체는 특정 항원에 해당하는 물질의 유무, 세포내의 분포, 많고 적음을 알 수 있는 좋은 시료이다. 이번 실험에서는 세포학 연구에 많이 쓰이는 항체를 얻기 위하여 쥐에 항원으로 GST(in BL21)를 injection하였다. Injection시 면역반응을 최대화하기 위하여 면역반응 촉진제로 Fruend`s Adjuvant를 사용하였는데, 첫 번째 접종에선 죽은 Mycobacterium을 포함한 Complete Freund`s Adjuvant(CFA)를 항원과 1:1비율로 섞은 후 사용하였다. 총 3주에 걸쳐 3번의 항원 injection이 이루어 졌는데 두 번째와 세 번째 injection시에는 Mycobacterium이 포함되지 않은 Incompete Freunds Adjuvant(IFA)를 항원과 1:1비율로 혼합하여 주입하였다. 이렇게 3주후에 3차 접종까지 끝낸 쥐를 잡아 ether로 마취시킨 후 배를 갈라 심장에 주사바늘을 찔러 혈액을 취하였다. 여기서 원심분리를 통해 얻어진 혈청을 immunobloting에 사용할 수 있게 1:1000으로 희석하였다. 아미노산, 단백질, 핵산등과 같은 하전된 물질들을 분리하는데 매우 효과적인 수단으로 이용되는 전기영동(electrophoresis)을 이용하여 단백질을 분리하였는데 SDS-PAGE를 이용하였다. Acrylmide와 bisacrylamide의 polymerization을 통해 만든 polyacrylamide gel을 이용하여 단백질과 같은 하전된 입자가 매우 뚜렷한 띠들로 분리될 수 있도록 변형한 방법인 discontinuous-gel electrophoresis에 SDS를 사용하여 단백질의 크기를 결정할 때와 단백질이 monomer인지 그렇지 않으면 oligomer인지를 결정할 때 유용하게 사용된다. 이 SDS-PAGE를 이용하여 GST의 분자량은 약 28 kDa임을 알 수 있었다. 이 분리한 gel상태에서의 항원 GST를 전기에 의해 nitrocellulose membrane에 transfer 한 후 쥐에서 추출한 serum을 western blot 시켜서 쥐에서 항원에 대한 항체가 생성되었는지

참고 자료

한국생화학회, 실험생화학, 1997, pp95~101
Lehninger, 생화학 2nd, 외국서적, pp147~150
Lehninger, 생화학 1st, 외국서적, pp147~153
박상대 분자세포생물학 1st, 아카데미서적, pp14~15